ILK对膀胱癌细胞增殖、凋亡、侵袭和活性氧的影响

高 娟,董兵卫,李 卓,张渭波(西安医学院第一附属医院检验科,西安 70077;咸阳市中心医院病理科;通讯作者,E-mail:5090687@63.com)

膀胱癌的发病率在男性泌尿生殖系统肿瘤中居首位,其发生、发展是一个多因素、多基因、多步骤的过程。2015年,膀胱癌在中国男性患者中的全年新发病例数约为6.2万例,且患者预后极差,引起了人们的广泛关注[1,2]。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)在各种肿瘤细胞内异常表达或激活,影响细胞的分化、侵袭和血管生成[3]。前期研究发现,ILK在膀胱癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生、发展中发挥协同效应,构成膀胱癌恶性生物学行为的基础[4]。膀胱癌细胞恶性增强的一个典型特点就是对化疗药物的敏感性降低,在目前应用的众多化疗药物中,紫杉醇药物治疗转移性膀胱癌的疗效尤为突出,多西紫杉醇可在改善症状的同时显著提高患者生存率,然而大于50%的患者发生耐药抵抗,目前机制还不清楚。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一种具有活性氧功能基团的化合物,其主要的产生场所是在细胞氧化系统中,主要包含氧自由基、过氧化物和激发态氧等,在病理状况下,大量的ROS对细胞的脂质、蛋白质以及DNA造成影响,导致细胞损伤[5]。迄今为止,ILK对多西紫杉醇耐药及活性氧的影响未见报道,因此,本文主要研究ILK高表达对膀胱癌细胞增殖、克隆形成和ROS水平的影响,以及在多西紫杉醇药物刺激下膀胱癌细胞凋亡和侵袭能力的变化。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、细胞及主要试剂

ILK过表达质粒,DH5α和膀胱癌5637细胞均由西安医学院第一附属医院中心实验室保存。T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、逆转录试剂盒、DNA marker DL600、DL2000及DL15000均购自宝生物工程(大连)有限公司;去内毒素质粒提取纯化试剂盒购自Omega公司;脂质体Lipofectamine2000和Trizol试剂购自Invitrogen公司;Am-blue细胞增殖、Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海生博医学生物工程科技有限公司;活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司,其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于37 ℃,5%CO2饱和湿度孵育箱中常规培养5637细胞,待细胞80%以上融合时进行传代。取对数生长期的细胞,按2×105个/孔接种至6孔板中,待细胞80%左右融合时,用脂质体Lipofectamine 2000将ILK过表达质粒转染5637细胞,并设未转染细胞对照。以1.6 mg/ml的G418筛选2周后,更换含0.8 mg/ml G418的培养基维持培养,4周后获得稳定表达细胞株。

1.2.2 Am-blue细胞增殖活力的检测 将实验分为膀胱癌细胞5637组和转染了过表达ILK的5637/ILK组。取对数生长期稳定转染的各组细胞，消化后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液制成单细胞悬液,以1×103个/孔接种于96孔培养板,每组设5个复孔,同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔,于37 ℃,5%CO2孵箱中培养;分别于培养1,2,3,4,5 d后,每孔加入Am-blue溶液,继续培养4 h,终止培养,于490 nm波长用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度值。以时间为横坐标,A490值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。并计算细胞生长增殖率，细胞生长增殖率(%)=(实验组A490均值/对照组A490均值-1)×100%。

1.2.3 克隆形成实验 取对数生长期的5637细胞,以100个/孔的细胞密度铺于6孔板。将其置于培养箱中正常培养。2周后,当细胞培养板中出现肉眼可见克隆时,终止培养。用PBS冲洗2次,用4%中性甲醇固定细胞15 min,用瑞氏-吉姆萨复合染色液染色30 min,流水缓慢洗涤后自然空气干燥。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数,按照如下公式计算克隆形成率:克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI法检测细胞凋亡 将实验分为5637组和5637/ILK组,取对数生长期的各组稳定转染细胞,调整细胞浓度为3×105个/ml,2 ml接种于6孔板,常规培养过夜(14 h左右)后,分别在两组中用孔内培养基稀释多西紫杉醇至目标剂量10 μmol/L,再常规培养24 h。胰酶消化后,PBS洗涤3次,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI Staining Solution,轻轻混匀,避光、室温反应10-15 min,加入400 μl 1×Binding Buffer混匀后放置于冰上,1 h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡,实验重复3次。

1.2.5 Transwell侵袭实验 将实验分为5637组和5637/ILK组,分别在两组中用孔内培养基稀释多西紫杉醇至目标剂量10 μmol/L,常规培养24 h后,涂抹细胞外基质50 μl至Millicell小室(8 μm孔径)基底膜内表面,4 ℃风干过夜。37 ℃细胞培养箱水化1 h,用无血清RPMI-1640培养基稀释细胞,接种100 μl密度为3×106/ml的细胞到上室,加入800 μl含10%FBS的RPMI-1640培养基至下室。37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养48 h,甲醇固定,0.1%结晶紫染色,200倍显微镜下观察计数,随机选取5个视野的细胞计数,取平均值。

1.2.6 ROS检测 利用活性氧检测试剂盒检测细胞中ROS水平。提取待测细胞,在PBS缓冲液中重悬至1×106个/ml,加入2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针,使细胞与DCFH-DA探针结合。避光37 ℃作用30 min,每隔3-5 min颠倒混匀一次;离心洗涤,重复此步骤3次以去除残留的DCFH-DA,重悬过筛后即可用流式细胞仪检测细胞中ROS水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力分析

Am-blue结果显示,在过表达外源性ILK后,5637/ILK组细胞的A490值于接种后第2天开始,显著高于5637组(见图1)。接种后1,2,3,4,5 d,5637/ILK组的增殖率分别为0,(14.14±0.35)%,(28.95±1.02)%,(37.06±0.89)%和(46.14±0.37)%。表明5637/ILK组细胞在静息状态下的增殖率显著高于5637组,尤其在培养中后期,这一差距更为明显。

2.2 各组细胞克隆形成能力分析

培养14 d时的克隆形成实验显示,5637/ILK组细胞的克隆集落形成率显著高于5637组(t=15.69,P<0.05,见图2)。提示5637/ILK组细胞的恶性转化程度更高。

2.3 各组细胞凋亡分析

流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果显示,在多西紫杉醇相同浓度刺激下,5637/ILK组的凋亡发生率与5637组相比显著降低,差异具有统计学意义(5.96%±0.23%vs75.36%±1.06%,P<0.05,见图3)。

与5637细胞组相比,*P<0.05,**P<0.01

与5637细胞组相比,*P<0.05

2.4 侵袭能力的改变

Transwell体外侵袭实验显示,在多西紫杉醇相同浓度刺激下,5637/ILK组细胞平均视野侵袭细胞数为127.4±54.95个,而5637组细胞的平均侵袭细胞数为48.3±42.95个,5637/ILK组细胞侵袭能力显著增加,差异有统计学意义(t=23.518,P<0.05,见图4)。说明多西紫杉醇药物刺激之后5637/ILK组细胞的侵袭性显著高于5637组细胞。

图3 流式细胞仪检测多西紫杉醇刺激下5637/ILK和5637组细胞的凋亡Figure 3 Apoptosis of 5637/ILK and 5637 cells uner the docetaxel action by flow cytometry

与5637细胞组相比,*P<0.05

2.5 ROS水平比较

实验结果显示,5637/ILK组细胞ROS荧光强度显著高于5637组,差异具有统计学意义(t=18.69,P<0.05,见图5),提示ILK的异常升高显著提升细胞内氧化应激状态。

与5637细胞组相比,*P<0.05

3 讨论

正常细胞必须依附于适宜的表面才能生长,悬浮于液体或半固体状态中培养则难以生长良好,这种现象称为生长的锚定依赖性(anchorage depen-dence for growth)。肿瘤在癌变过程中,发生转化的细胞也具有上述特征,恶性肿瘤细胞对外源生长刺激因子的依赖减少、失去细胞接触抑制效应,并通常导致永生化,这种锚定不依赖性生长是肿瘤细胞的标识之一,也是检测恶性转化细胞最准确和严谨的标识。因此过表达ILK的膀胱癌细胞在软琼脂中的生长增高说明了其在促进膀胱癌细胞增殖或维持恶性状态中的必要性。

ILK过度表达可能是恶性肿瘤的基本特征,其表达水平的高低与肿瘤的预后、病理分期等有关,ILK在胶质瘤、舌鳞癌、膀胱癌等肿瘤组织内异常高表达,基因剔除膀胱癌、舌鳞癌、胶质瘤等肿瘤细胞内的ILK,肿瘤的恶性程度降低[6]。本文研究显示,ILK作用下膀胱癌细胞的增殖率显著增高,说明ILK可以促进膀胱癌细胞的增殖能力。多西紫杉醇的抗肿瘤机制为促进微管蛋白聚合并抑制其解聚、抑制肿瘤细胞有丝分裂,主要杀伤处于S期的肿瘤细胞[7,8]。本研究发现,加用多西紫杉醇的5637/ILK组细胞的凋亡明显减少,侵袭性显著增高,提示ILK的异常升高很可能是肿瘤细胞抵抗多西紫杉醇的重要病理机制之一。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要包括超氧离子、氢氧自由基和过氧化氢,它们是在代谢过程中从线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ释出的副产物,高水平ROS往往对细胞产生显著伤害效应,可导致DNA损伤、蛋白质氧化以及脂质功能紊乱,从而引起细胞代谢、功能异常。越来越多证据显示,ROS的不同成分还可作为细胞第二信使参与调控细胞代谢的不同生理病理过程,包括细胞周期、自噬、细胞凋亡、内质网应激、细胞能量代谢和细胞衰老等。ROS在细胞内信号转导通路中发挥着重要作用,是TGF-β1等多种细胞因子的第二信使,在ERK1/2、JNK信号转导途径中起调节作用,对细胞增殖有介导能力[9]。在膀胱癌,ROS与癌细胞的异常增殖、化疗抵抗性和转移、侵袭过程均密切相关,是在不同病理发生过程中均发挥关键调控作用的重要信号通路之一。本文研究表明,膀胱癌细胞在过表达ILK刺激下ROS水平出现了明显的升高,提示ILK的异常升高显著提升细胞内氧化应激状态,所以ILK的促癌效应很可能与氧化应激状态异常升高有关,这一科学猜想有待进一步研究证实。

综上所述,ILK过表达能促进膀胱癌细胞增殖和克隆形成,并且增强ROS的表达水平。同时,在多西紫杉醇药物的作用下,膀胱癌细胞的凋亡减少,侵袭增加。研究提示高表达的ILK可能与膀胱癌多西紫杉醇耐药和细胞内氧化应激状态有关,相关机制研究正在进行中。