核桃仁乙醇提取物通过调节BDNF/TrkB信号通路改善阿尔兹海默病大鼠学习记忆功能

潘建萍，钟禹霖，邓 华

(赣南卫生健康职业学院，江西 赣州 341000)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是临床上常见的中枢神经系统退行性疾病，且随着社会老龄化问题加剧和人口寿命的延长，AD发病率有逐年升高之趋势，严重影响老人的身心健康和生活质量[1-2]。学习记忆能力下降、认知功能障碍等是AD发病的主要临床特征。目前AD发病确切机制尚不明确，临床仍无特效治疗药物。核桃自古作为健脑食品，《本草纲目》中记载核桃可令人肥健、添脑髓。虽有不少研究结果[3-5]表明核桃通过调节胆碱酯酶和抗氧化作用改善AD大鼠的空间学习记忆能力，但是关于核桃发挥抗AD的确切分子机制仍需深入。本研究采用大鼠侧脑室注射Aβ1-40复制AD模型，探讨核桃仁乙醇提取物对模型大鼠的空间学习记忆的改善作用及其分子生物学作用机制。

1 资料与方法

1.1 动物及分组

选取SD大鼠随机分为模型对照组和A、B、C(低、中、高剂量)治疗组。A组核桃仁提取生药0.05 g/100 g灌胃，B组核桃仁提取生药0.15 g/100 g灌胃，C组核桃仁提取生药0.5 g/100 g灌胃，以口服蒸馏水作为对照。

1.2 主要试剂及仪器

BACE1和ADAM10检测试剂盒购自Thermo Fisher公司；兔抗鼠BDNF抗体、兔抗鼠p-TrkB、兔抗鼠p-CREB和羊抗兔IgG-HRP二抗均购自Abcam公司。

1.3 大鼠学习记忆能力检测

采用Morris检测大鼠学习记忆能力，首先对大鼠进行适应性练习，大鼠每天在固定时间点进入水中练习，1次/d，60 s/次。连续练习6 d。实验中研究人员记录大鼠进入水池运动动态及逃避潜伏期、平台穿越次数。

1.4 大鼠海马组织中BACE1、ADAM10活性检测

大鼠Morris水迷宫实验结束后，处死大鼠并解剖分离海马组织，将含有蛋白酶抑制剂T-PER试剂与海马组织混合制备匀浆，以温度4 ℃、离心速度16 000 r/min离心60 min，收集上层清液并测定总蛋白浓度，按ELISA试剂盒操作步骤进行ADAM10、BACE1酶活性测定。

1.5 大鼠海马组织中BDNF、P-TrkB蛋白和TrkB蛋白表达水平检测

采用Western blot法检测。取新鲜冰冻的海马按比例加入裂解液进行匀浆，匀浆后充分裂解30 min，12 500 r/min离心10 min后取上清。取出100 μL上清液加上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min使蛋白变性，以BCA法进行蛋白定量，以 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法转移至PVDF膜，室温下用封闭液封闭2 h后，加入兔抗鼠BDNF抗体(1∶500 Abcam，英国)、兔抗鼠p-TrkB(1∶200 Abcam，英国)和兔抗鼠p-CREB抗体(1∶200 Abcam，英国)4 ℃孵育过夜或37 ℃孵育2 h，TBS缓冲液冲洗3次，加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBS缓冲液冲洗后，化学发光法显色。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫行为学检测结果比较

A、B、C组大鼠逃避潜伏期明显短于对照组，平台穿越次数明显多于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

组别大鼠数(n)逃避潜伏期(s)平台穿越次数(次)A组636.75±7.54∗1.97±0.52∗B组628.92±6.86∗∗2.88±0.78∗C组625.63±6.24∗∗3.25±0.94∗∗对照组642.18±7.651.56±0.36

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各组大鼠海马组织中ADAM10、BACE1酶活性比较

A、B、C三组与对照组比较，核桃仁乙醇提取物上调海马组织中ADAM10表达，下调BACE1表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

组别大鼠数(n)ADAM10BACE1A组6167.52+21.56448.12+45.75∗B组6208.38+24.68∗405.73+43.54∗C组6234.21+26.34∗∗368.38+38.96∗∗对照组6140.96+16.56512.45+64.82

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各组大鼠海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白表达比较

A、B、C三组与对照组比较，BNDF、P-TrkB、p-CREB蛋白质表达水平明显上升，C组变化更突出，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 各组大鼠海马组织BDNF/TrkB通路相关蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

本研究采用低、中、高三个剂量在对AD大鼠干预1个月后采用Morris水迷宫判断其行为功能水平及用分子生物学方法研究其作用机制。研究结果显示，经用核桃仁乙醇提取物干预后，逃避潜伏期缩短，平台穿越次数增多，学习记忆能力较模型对照组改善，且呈剂量浓度依赖性，差异具有统计学意义，提示核桃仁乙醇提取物具有改善AD大鼠的学习记忆功能。

阿尔茨海默病发病机制较为复杂，但主要是Aβ在海马等重要脑区部位沉积并形成老年斑，从而神经功能受到损伤，导致认知功能障碍[6-7]。近年来，随着对β淀粉蛋白前体蛋白(APP)处理途径认识的不断深入，APP降解的关键酶在AD发病中的作用越来越被重视。α分泌酶(ADAM10)和BACE1是降解APP作用截然不同的两个重要关键酶，同时也是治疗AD的重要药物靶点。有研究发现，ADAM10有切割APP功能的α分泌酶活性，将AD小鼠与ADAM10转基因小鼠杂交或将大鼠过表达 ADAM10基因发现淀粉样斑块明显减少，可溶性产物APPs-α增多，学习和记忆功能障碍明显改善[8-10]。而AD模型鼠和患者脑中BACE1的蛋白表达水平显著高于同龄野生鼠[11-12]和非AD患者；反之，通过SiRNA沉默或基因敲除等手段抑制BACE1酶活性可使APP裂解产生Aβ减少，淀粉样斑块减轻[13-14]。为探究核桃仁乙醇提取物改善大鼠学习记忆功能是否与APP降解酶相关，研究中检测了ADAM10和BACE1酶活性。本研究结果表明，核桃仁乙醇提取物提高AD模型大鼠的学习记忆能力，其作用机制与上调海马组织中ADAM10表达水平和下调BACE1表达有关。

核桃仁乙醇提取物通过调控APP降解的两个重要关键酶，从而改善AD大鼠的学习记忆障碍。为探究其更深层次的分子生物学机制，研究中进一步检测了BDNF/TrkB信号通路。BDNF/TrkB通路在神经再生及突触功能重塑中发挥着重要作用，能够改善AD认知障碍。Arancibia S等[15]、Kimura N等[16]发现激活BDNF/TrkB通路能抑制Aβ对神经元的毒性反应，并且该过程能被TrkB受体特异性抑制剂阻断；阻断海马神经元的BDNF/TrkB信号通路使胞内外Aβ沉积增加并且激活其毒性，导致神经元死亡。Li N等[17]研究表明，Aβ的沉积导致APP/PS1小鼠海马部位BDNF/TrkB/CREB信号通路功能障碍。本研究结果显示，A、B、C三组中BNDF、p-CREB、p--TrkB蛋白质表达水平明显上升，C组变化最突出，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示BDNF/TrkB/CREB信号通路可能参与核桃仁乙醇提取物改善AD大鼠学习记忆功能的调节。

综述所述，核桃仁乙醇提取物通过调节APP降解的两个重要关键酶，改善AD大鼠空间学习记忆能力，这种作用可能是通过调节BDNF/TrkB/CREB信号通路实现。