活络止痛丸对风湿痹症模型大鼠的治疗作用及机制研究

徐 杰，王宝成，姜文月*，王美慧，杨明爽，苏小红，李芯茹

(1.吉林省现代中药工程研究中心有限公司，吉林 长春 130012；2.通药制药集团股份有限公司，吉林 通化 134001)

目前类风湿关节炎(RA)动物模型有很多，如佐剂诱导的关节炎、卵蛋白诱导的关节炎、Ⅱ型胶原诱导的关节炎、多聚糖蛋白诱导的关节炎模型等。其中，佐剂性关节炎模型与人RA在发病机制、临床表现、病理、免疫等方面有着相似或相近的特点，且弗氏完全佐剂的操作简便易行，造模周期较短，重复性好，可同时获得大量模型动物，对RA的基础研究十分适宜。

本研究采用佐剂性关节炎模型作为实验动物模型，通过外界施以“风寒湿”和“风湿热”的致病因素制备风寒湿痹与风湿热痹两类病证结合动物模型，观察活络止痛丸对风寒湿痹与风湿热痹模型大鼠的治疗作用，并探讨其治疗风湿痹症的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 动物

Wistar大鼠，雄性，体重180～220 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，实验动物生产许可证为SCXK(吉)-2018-0007。

1.2 药物与试剂

活络止痛丸(批号：180501)由通药制药集团股份有限公司提供；万通筋骨片(批号：02171213K)购自通化万通药业股份有限公司；弗氏完全佐剂(批号：SLBR3897V)购自Sigma公司；大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫检测试剂盒(批号：20190301)、大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫检测试剂盒(批号：20190301)、大鼠前列腺素E2(PGE2)酶联免疫检测试剂盒(批号：20190301)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号：20190301)、丙二醛(MDA)测试盒(批号：20190227)均购自南京建成生物工程研究所；氯化钠注射液(批号：1805090401)购自吉林省都邦药业股份有限公司。

1.3 仪器

FS40-8B1电风扇(美的环境电器制造有限公司)；FS40-301电风扇(佛山市顺德区晟亚电器有限公司)；DK-98-ⅡA水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；DHG-9245A鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Spectra Max Plus 384型酶标仪(美国美谷分子仪器有限公司)；JY2003电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；TDZ5-WS台式低速多管自动平衡离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司)。

2 方法

2.1 给药剂量

按照活络止痛丸产品说明书用法与用量要求，口服，一次4 g，一日3次。每人按平均60 kg计算为0.2 g/kg/d/人，折算大鼠给药剂量为1.25 g/kg，故设立低剂量(1.25 g/kg)和高剂量(2.5 g/kg)。

按照万通筋骨片(阳性药)产品说明书用法与用量要求，口服，每片0.28 g，一次2片，一日2～3次。每人按平均60 kg计，每天口服6片算为0.028 g/kg/d/人，折算大鼠给药剂量为0.175 g/kg。

2.2 建立风湿痹证模型[1-7]

风寒湿痹模型：Wistar大鼠随机分为空白组、风寒湿痹模型组、万通筋骨片、活络止痛丸高剂量与低剂量组，共5组，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠在造模的第1天，每只大鼠注射弗氏完全佐剂0.1 mL于左后足跖皮内1次，造模7 d后再注射0.1 mL加强免疫，建立佐剂性关节炎大鼠模型，并将大鼠置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，伴以3档风力，每日1次，每次20 min，连续14 d。自造模第15天起，各给药组大鼠灌胃给药，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续21 d。

风湿热痹模型：Wistar大鼠随机分为空白组、风湿热痹模型组、万通筋骨片、活络止痛丸高剂量与低剂量组，共5组，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠在造模的第1天，每只大鼠注射弗氏完全佐剂0.1 mL于左后足跖皮内1次，造模7 d后再注射0.1 mL加强免疫，建立佐剂性关节炎大鼠模型，并将大鼠置于36～38 ℃热水中，水深2 cm，伴以3档风力，同时给予37 ℃水浴恒温热蒸汽熏蒸，每日1次，每次20 min，连续14 d。自造模第15天起，各给药组大鼠灌胃给药，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续21 d。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 一般状况观察 观察各组大鼠体质量、毛色、活动等情况。

2.3.2 足肿胀度 第35天末次给药后测定各组大鼠致炎足的足跖容积。

2.3.3 关节炎指数 关节炎评分标准如下：后足无关节炎表现计0分；后足1～2个关节发红，软组织肿胀计1分；后足3～4个关节发红，软组织肿胀计2分；后足5个或更多关节发红，软组织肿胀计3分；后足严重关节炎计4分。

2.3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2及SOD、MDA水平 第35天末次给药后1 h，腹主动脉取血，静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，分离血清。用试剂盒测定大鼠血清 TNF-α、IL-1β、PGE2、SOD、MDA的水平，具体操作按说明书步骤进行。

2.4 统计学处理

本研究利用SPSS17.0软件进行数据统计分析，组间比较采用双侧独立样本t检验。

3 结果

3.1 一般状况观察

在整个实验过程中，空白组大鼠精神状态良好，毛发光滑有光泽，活动自如，体重增加较快；风寒湿痹和风湿热痹模型组大鼠右后足跖致炎后肿胀明显，毛色泛黄而无光泽，活动减少，精神不振，个别大鼠右后肢足跖及踝关节出现溃烂、脱毛现象，体重增长缓慢；给予万通筋骨片及活络止痛丸干预后，上述症状均明显缓解，但模型组基本无变化。

3.2 足肿胀度

与空白组相比，风寒湿痹模型组致炎后足跖容积显著升高(P<0.001)；与风寒湿痹模型相比，活络止痛丸高剂量组与万通筋骨片组显著降低足跖容积(P<0.01，P<0.05)，活络止痛丸低剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表1。

与空白组相比，风湿热痹模型组致炎后足跖容积显著升高(P<0.001)；与风湿热痹组模型相比，活络止痛丸高剂量组与万通筋骨片组显著降低足跖容积(P<0.05，P<0.05)，活络止痛丸低剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表1。

组别给药剂量(g/kg)足肿胀度(mm)风寒湿痹模型风湿热痹模型空白组-4.578±0.3084.578±0.308模型组-6.467±0.562∗∗∗6.471±0.430∗∗∗万通筋骨片组0.185.887±0.382#∗∗∗5.865±0.338#∗∗∗活络止痛丸低剂量组1.256.567±0.356∗∗∗6.691±0.539∗∗∗活络止痛丸高剂量组2.505.854±0.256##∗∗∗5.838±0.293#∗∗∗

注：与空白组比较：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

3.3 关节炎指数

与空白组相比，风寒湿痹模型组致炎后关节炎指数评分显著升高(P<0.001)；与风寒湿痹模型相比，活络止痛丸高剂量组与万通筋骨片组显著降低关节炎指数评分(P<0.05，P<0.05)，活络止痛丸低剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表2。

与空白组相比，风湿热痹模型组致炎后关节炎指数评分显著升高(P<0.001)；与风湿热痹模型组相比，活络止痛丸高剂量组与万通筋骨片组显著降低关节炎指数评分(P<0.001，P<0.01)，活络止痛丸低剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表2。

组别给药剂量(g/kg)关节炎指数风寒湿痹模型风湿热痹模型空白组-00模型组-2.600±0.866∗∗∗2.900±0.972∗∗∗万通筋骨片组0.181.778±0.744#∗∗∗1.900±0.333##∗∗∗活络止痛丸低剂量组1.252.100±0.333∗∗∗2.500±0.726∗∗∗活络止痛丸高剂量组2.501.875±0.000#∗∗∗1.400±0.500###∗∗∗

注：与空白组比较：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2及SOD、MDA水平

3.4.1 细胞因子TNF-α和IL-1β TNF-α：与空白组相比，风寒湿痹模型组TNF-α水平显著升高(P<0.05)，与风寒湿痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低TNF-α水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；与空白组相比，风湿热痹模型组TNF-α水平显著升高(P<0.05)，与风湿热痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低TNF-α水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。实验结果见表3。

IL-1β：与空白组相比，风寒湿痹模型组IL-1β水平显著升高(P<0.01)，与风寒湿痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低IL-1β水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；与空白组相比，模型风湿热痹组IL-1β水平显著升高(P<0.05)，与模型风湿热痹组相比，万通筋骨片与活络止痛丸高剂量组均显著降低IL-1β水平(P<0.05，P<0.05)，活络止痛丸低剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表3。

组别给药剂量(g/kg)TNF-α(ng/L)风寒湿痹模型风湿热痹模型IL-1β(ng/L)风寒湿痹模型风湿热痹模型空白组-155.520±30.806155.520±30.80618.343±5.19818.343±5.198模型组-258.007±102.397∗225.613±61.889∗25.861±5.357∗∗26.162±7.680∗万通筋骨片组0.18159.766±44.005#162.709±34.756#18.397±5.953#18.367±3.312#活络止痛丸低剂量组1.25147.470±38.960##125.621±56.151##18.073±4.329##21.610±7.101活络止痛丸高剂量组2.50158.906±35.065#145.788±45.081#19.736±4.987#18.762±3.452#

注：与空白组比较：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

3.4.2 PGE2 与空白组相比，风寒湿痹模型组PGE2水平显著升高(P<0.05)；与风寒湿痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低PGE2水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。实验结果见表4。

与空白组相比，风湿热痹模型组PGE2水平显著升高(P<0.05)；与风湿热痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低PGE2水平(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。实验结果见表4。

3.4.3 SOD和MDA SOD：与空白组相比，风寒湿痹模型组SOD活力显著降低(P<0.01)，与风寒湿痹模型组相比，万通筋骨片与活络止痛丸高剂量组显著升高SOD活力(P<0.05，P<0.05)，低剂量无显著性差异(P>0.05)；与空白组相比，风湿热痹模型组SOD活力显著降低(P<0.001)，与风湿热痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著升高SOD活力(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。实验结果见表5。

MDA：与空白组相比，风寒湿痹模型组MDA水平显著升高(P<0.001)，与风寒湿痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低MDA水平(P<0.001，P<0.001，P<0.001)；与空白组相比，风湿热痹模型组MDA水平显著升高(P<0.001)，与风湿热痹模型组相比，万通筋骨片、活络止痛丸低剂量与高剂量组均显著降低MDA水平(P<0.05，P<0.001，P<0.01)。实验结果见表5。

组别给药剂量(g/kg)PGE2(ng/L)风寒湿痹模型风湿热痹模型空白组-193.020±38.369193.020±38.369模型组-240.678±25.144∗242.463±32.062∗万通筋骨片组0.18195.801±37.863#200.215±28.561#活络止痛丸低剂量组1.25190.730±33.718##191.571±22.377##活络止痛丸高剂量组2.50198.518±32.982#186.495±32.609##

注：与空白组比较：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

组别给药剂量(g/kg)SOD(U/mL)风寒湿痹模型风湿热痹模型MDA(nmol/mL)风寒湿痹模型风湿热痹模型空白组-164.342±6.917164.342±6.9173.689±0.3643.689±0.364模型组-144.450±15.191∗∗141.790±9.245∗∗∗12.035±0.908∗∗∗11.371±1.531∗∗∗万通筋骨片组0.18158.300±8.309#166.183±13.441##6.768±1.285###∗∗∗8.851±2.565#∗∗∗活络止痛丸低剂量组1.25156.925±13.787153.992±11.665#4.849±1.954###5.540±1.705###∗∗活络止痛丸高剂量组2.50159.573±8.438#158.140±11.233##6.698±1.966###∗∗∗7.390±2.261##∗∗∗

注：与空白组比较：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

4 讨论

本研究采用弗氏完全佐剂诱导佐剂性关节炎，通过外界施以“风寒湿”和“风湿热”的致病因素制备风寒湿痹与风湿热痹两类病证结合动物模型，观察活络止痛丸对风寒湿痹与风湿热痹模型大鼠的治疗作用，并探讨其治疗风湿痹证的作用机制。试验结果表明，与风寒湿痹及风湿热痹模型组相比，活络止痛丸可显著降低足肿胀度、关节炎指数、血清IL-1β、TNF-α、PGE2、MDA水平，升高血清SOD水平，对风湿痹证模型大鼠具有治疗作用，为临床合理使用提供了理论依据。