肾康汤对大鼠长期毒性试验研究

余家奇，刘 莉，吴 芹，罗 勇，杨忠兰，刘培洪

(1.遵义市第一人民医院(遵义医科大学三附院)药剂科，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室，贵州 遵义 563000)

肾康汤为遵义医学院第三附属医院中医学教授刘莉的经验方，由炙附子、菟丝子、淫羊藿、黄芪、茯苓、党参、金银花、蒲公英等中药饮片组成，具有温肾补阳摄精、健脾利水消肿、活血化瘀解毒之功效[1]，根据十余年的临床应用有效率达71.69%。临床研究证实该方能显著改善CRF患者症状，提高CRF患者生活质量，延缓CRF患者肾衰进程[2]；药效学实验表明肾康汤能明显改善慢性肾衰的病症，其作用机制可能与抑制bFGF蛋白表达相关。

为了给临床安全用药提供参考依据，本实验以血液学、血清生化学、组织病理学为主要指标，观察大鼠长期口服肾康汤干浸膏后对机体是否产生积蓄性及迟缓性的中毒反应，并提供毒性反应的靶向器官及损害的可逆性。

1 材料与方法

1.1 受试药物

肾康汤干浸膏(深褐色)由遵义市第一人民医院余家奇主任药师提供(批号：2018.05.10)。剂量组别：肾康汤低剂量组1.15 g/kg(相当于临床用量5倍)，中剂量组3.45 g/kg(相当于临床用量的15倍)，高剂量组6.90 g/kg(相当于临床用量的30倍)，空白对照组给予同体积蒸馏水。给药途径：灌胃给药，与临床给药途径一致。药物配制：根据给药剂量不同，药品研磨后用无菌蒸馏水溶解与混匀，制成混悬液，每天配制1次。

1.2 试验大鼠

SD大鼠80只(雌和雄性各40只)，由第三军医大学大坪医院实验大鼠中心提供，实验大鼠合格证号SCXK(渝):2012007；实验大鼠SPF级；2018年5月6日购入；每日自由摄食(颗粒饲料)，采用高压灭菌消毒(第三军医大学大坪医院实验大鼠中心提供)；饮用水自来水经灭菌后使用(定期添加维生素B)，大鼠从饮水瓶中自由摄取。大鼠饲养于二级试验大鼠实验室条件下，室内温度19～22 ℃、相对湿度40%～50%。给药前1周观察大鼠一般状况，取健康活泼、体质量(150±20)g SD大鼠用于正式实验。

2 方法

2.1 分组与给药

参考文献[3-5]按将80只大鼠随机分为4组各20只，分别为对照组、肾康汤高剂量组(6.9 g/kg，30倍于临床用药)、中剂量组(3.45 g/kg，15倍于临床用药)，低剂量组(1.15 g/kg，5倍于临床用药)。每天给药1次，于给药3个月和停药2周(恢复期)后各组分别处死10只大鼠进行指标检测。

2.2 观察指标

2.1.1 一般情况观察 给药期间观察大鼠外观、行为活动、饮食、粪便及毛发情况，并记录体质量、进食量、进水量。

2.2.2 SD大鼠血液学检查 采用Bayer-120(德国)全自动血球计数仪测定白细胞(RBC)、红细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)、网织红细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、凝血时间等。

2.2.3 SD大鼠血清生化检测 采用Olympus AU2700型全自动生化测定仪，测定门冬氨基酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TCHO)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CRE)、总蛋白(TP)、血蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白比值(A/G)。

2.2.4 SD大鼠系统尸解及脏器系数 全面观察每只大鼠的脏器，称量每只大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑、肾上腺、胸腺、甲状腺(含甲状旁腺)、子宫、卵巢，并计算脏器系数(脏器重/体质量×100 %)。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 肾康汤对SD大鼠一般状况的影响

连续给药肾康汤3个月，3组给药SD大鼠的被毛外观体征、行为活动、粪便、进食量等未见异常，无中毒情况，但是中剂量编号SKT-Z14雄性大鼠、低剂量编号SKT-D20雌性大鼠分别于灌胃给药第10周、11周死亡，解剖发现死亡原因是灌胃误入气管所致。3组大鼠进食量、饮水量、体质量与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3.2 肾康汤对SD大鼠血液学指标的影响

在给药3个月后，肾康汤高、中、低剂量组SD大鼠液学指标与对照组比较无明显差异。结果见表1、表2。

3.3 肾康汤对SD大鼠血液生化指标的影响

3.3.1 给药3个月对大鼠血清生化的影响 给药3个月(12周)后检查SD大鼠血清生化16项指标(钠、钾、氯、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、A/G、尿素BUN、肌酐、甘油三酯、总胆固醇、血糖、肌酸激酶)，检查结果见表3。

3.3.2 肾康汤停药恢复期SD大鼠血清生化检察 停止给药后2周(第14周)检查SD大鼠血清生化16项指标(钠、钾、氯、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、A/G、尿素BUN、肌酐、甘油三酯、总胆固醇、血糖、肌酸激酶)，检查结果见表4。

指标对照组高剂量组中剂量组低剂量组WBC(109/L)4.41±2.025.7±3.735.39±3.394.17±2.87NEUT(%)0.19±0.110.16±0.080.19±0.110.18±0.1LYMPH(%)0.79±0.120.81±0.10.79±0.110.79±0.1MONO(%)0.02±0.010.02±0.010.02±0.020.02±0.02RBC(1012/L)8.80±0.819.18±0.818.66±0.549.0±0.64Hb(g/L)157.58±8.13163±8.26157.42±7.09161.17±8.3HCT(L/L)0.49±0.020.61±0.310.48±0.020.50±0.03MCH(pg)18.01±1.3417.83±0.9818.22±0.6917.94±0.71BPC(109/L)991.33±150.14876.5±125.26944.42±84.1950.33±131.63RETIC(109/L)324.35±101.49278.89±86.4280.33±89.72269.43±109.21PT(sec)7.50±0.627.61±0.787.46±0.687.33±0.34PTR0.64±0.050.64±0.070.63±0.050.62±0.03

指标对照组高剂量组中剂量组低剂量组WBC(109/L)10.05±3.659.23±3.1410.5±4.029.63±2.05NEUT(%)0.14±0.040.11±0.040.13±0.080.13±0.07LYMPH(%)0.84±0.050.87±0.040.82±0.080.85±0.08MONO(%)0.04±0.040.01±0.010.04±0.050.01±0.01RBC(1012/L)9.16±0.659.51±0.619.15±0.499.24±0.53Hb(g/L)165.13±5.82167.5±8.23164.29±5.12166.43±4.5HCT(L/L)0.51±0.020.51±0.020.5±0.020.51±0.02MCH(pg)18.09±0.8317.68±0.5217.97±0.5818.04±0.88BPC(109/L)1038.25±121.98883±161.28∗952.71±207.77976.71±85.1RETIC(109/L)241.59±74.2212.69±58.77236.93±89.58210.44±83.39PT-INR0.96±0.310.86±0.330.98±0.360.88±0.33PT(sec)12.03±4.0210.53±4.2412.1±4.6410.79±4.32PT(%)105.63±37.63120.25±41.08104.14±43.05117.29±41.07PTR0.94±0.281.05±0.271.19±0.05∗0.86±0.3

注：与对照组比较，*P<0.05。

指标对照组高剂量组中剂量组低剂量组K(mmol/L)5.97±1.035.26±0.815.02±0.42∗∗5.49±0.76Na(mmol/L)137.53±2.38137.47±1.44138.38±1.12138.58±1.83Cl(mmol/L)101.09±1.98101.61±1.44101.54±1.42101.78±1.96ALT(U/L)43.50±7.4332.75±5.59∗∗37.5±15.1836.17±6.89∗AST(U/L)129.58±27.4896.01±7.86∗∗106.01±17.66∗121.5±32.45ALP(U/L)88.00±30.4683.83±26.5682.67±32.1392.83±24.90TBIL(μmol/L)1.58±0.972.20±0.912.77±0.59∗∗2.16±0.59TP(g/L)66.71±6.6766.43±4.0966.16±3.7869.12±4.65ALB(g/L)30.98±3.2931.41±2.1931.47±2.2731.3±2.57UREA(mmol/L)6.55±2.085.98±1.275.36±0.875.8±0.7CREA(μmol/L)50.01±5.5341.92±7.32∗∗43.5±6.26∗44.5±7.67TG(mmol/L)0.65±0.170.53±0.180.77±0.210.69±0.32CHOL(mmol/L)1.87±0.271.59±0.391.67±0.51.87±0.53GLU(mmol/L)8.01±2.427.54±1.996.35±1.19∗5.58±2∗CK(U/L)965.25±695.41580.83±418.37552.5±164.12647.17±404.84A/G1.40±1.840.90±0.080.91±0.080.83±0.06

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

指标对照组高剂量组中剂量组低剂量组K(mmol/L)6.21±0.296.00±1.196.57±2.535.98±0.84Na(mmol/L)137.31±2.43136.46±1.5136.05±1.36137.6±1.37Cl(mmol/L)102.71±1.3102.78±2.7101.09±3.79103.24±1.82ALT(U/L)41.75±9.937.00±8.7738.71±6.5534.71±5.71AST(U/L)97.63±17.5191.75±7.6378.43±11.87∗92.43±12.37AKP(U/L)93.38±61.1791.00±73.97123.14±103.6995.86±70.54TBIL(μmol/L)2.13±0.221.81±0.851.81±0.621.59±0.51∗TP(g/L)67.56±4.1666.85±6.0967.91±5.5964.74±4.51ALB(g/L)31.75±3.4231.29±3.1430.79±1.5931.29±3.5UREA(mmol/L)6.06±0.965.89±1.045.53±0.765.96±0.88CREA(μmol/L)46.63±4.4442.88±10.4444.71±6.2644.86±3.08TG(mmol/L)0.58±0.330.81±0.750.77±0.740.82±0.35CHOL(mmol/L)2.02±0.611.85±0.451.91±0.32.02±0.62GLU(mmol/L)7.34±1.288.76±1.4611.01±1.46∗∗8.56±2.25CK(U/L)416.38±270.85526.38±421.3287.86±110.31468.86±222.22A/G0.89±0.090.88±0.070.84±0.080.93±0.09

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 肾康汤对SD大鼠脏器重量的影响

SD大鼠给药3个月和恢复期各给药组与空白对照组脏器重量比较，结果见表5、表6。

项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组体质量(g)293.50±29.20345.60±87.55363.55±82.17∗330.00±66.42脏器质量(g)心1.09±0.161.04±0.151.11±0.230.99±0.17肺1.89±0.331.80±0.281.97±0.561.91±0.41脑1.91±0.071.97±0.101.93±0.101.95±0.10脾0.65±0.140.63±0.090.65±0.120.62±0.15肝9.06±1.848.47±1.688.37±2.778.53±1.71肾2.08±0.532.01±0.402.18±0.442.06±0.46肾上腺0.07±0.020.07±0.010.07±0.020.07±0.02前列腺0.75±0.070.74±0.100.87±0.170.76±0.08甲状腺0.03±0.040.02±0.000.02±0.010.02±0.01睾丸3.47±0.153.74±0.253.87±0.27∗3.56±0.34附睾1.19±0.051.28±0.121.28±0.121.18±0.12子宫0.75±0.220.76±0.180.72±0.270.54±0.06卵巢0.13±0.020.13±0.020.13±0.010.12±0.02胸腺0.33±0.060.35±0.090.40±0.110.35±0.06脏器系数(%)心0.37±0.050.30±0.06∗∗0.30±0.04∗∗0.30±0.04∗∗肺0.65±0.120.51±0.09∗∗0.53±0.12∗0.59±0.19脑0.66±0.070.57±0.140.55±0.11∗∗0.60±0.11脾0.23±0.060.18±0.04∗0.18±0.03∗0.18±0.02∗肝3.09±0.582.38±0.45∗∗2.35±0.72∗2.57±0.32∗肾0.71±0.160.56±0.10∗0.60±0.070.62±0.10肾上腺0.02±0.010.02±0.010.02±0.010.02±0.01前列腺0.24±0.020.17±0.3∗∗0.20±0.040.20±0.02∗∗甲状腺0.01±0.010.01±0.000.01±0.000.01±0.00睾丸1.12±0.070.87±0.11∗∗0.89±0.07∗∗0.92±0.13∗附睾0.38±0.020.30±0.04∗∗0.29±0.03∗∗0.31±0.04∗∗子宫0.28±0.100.26±0.070.25±0.110.20±0.03卵巢0.05±0.010.04±0.010.04±0.010.04±0.01胸腺0.12±0.030.10±0.030.11±0.030.11±0.02

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

项目对照组(n=8)低剂量组(n=7)中剂量组(n=7)高剂量组(n=7)体质量(g)371.88±95.85368.33±93.37358.00±56.69349.50±78.40脏器质量(g)心1.09±0.201.07±0.161.09±0.121.03±0.15肺1.93±0.231.91±0.451.92±0.281.74±0.36脑2.05±0.082.01±0.061.99±0.061.96±0.12脾0.69±0.160.65±0.110.70±0.090.64±0.12肝9.95±3.0410.08±3.1910.97±2.929.31±2.46肾2.21±0.382.15±0.542.12±0.332.11±0.40肾上腺0.06±0.010.05±0.01∗0.07±0.010.06±0.01前列腺0.54±0.210.71±0.090.75±0.030.73±0.22甲状腺0.02±0.000.02±0.010.02±0.000.02±0.01睾丸3.51±0.193.65±0.343.70±0.023.73±0.23附睾1.08±0.231.22±0.031.27±0.011.20±0.10子宫0.61±0.100.58±0.170.61±0.120.61±0.12卵巢0.14±0.020.11±0.020.14±0.010.12±0.02胸腺0.38±0.110.35±0.130.42±0.110.27±0.06∗脏器系数(%)心0.30±0.030.30±0.040.31±0.020.30±0.03肺0.54±0.080.55±0.110.57±0.080.51±0.10脑0.58±0.140.58±0.150.57±0.080.59±0.12脾0.19±0.040.18±0.030.20±0.030.18±0.03肝2.69±0.492.75±0.573.12±0.792.68±0.46肾0.61±0.070.59±0.070.60±0.070.61±0.03肾上腺0.02±0.010.01±0.000.02±0.010.02±0.01前列腺0.12±0.060.15±0.020.18±0.010.17±0.05甲状腺0.01±0.000.01±0.000.01±0.000.01±0.00睾丸0.79±0.110.80±0.130.88±0.090.88±0.09附睾0.25±0.070.27±0.010.28±0.020.28±0.02子宫0.21±0.030.21±0.060.22±0.040.22±0.04卵巢0.05±0.010.04±0.010.04±0.010.04±0.01胸腺0.10±0.020.10±0.030.12±0.040.08±0.01∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

4 讨论

4.1 肾康汤对SD大鼠摄食量和体质量增长的影响

SD大鼠分别灌胃肾康汤1.15 g/kg、3.45 g/kg、6.90 g/kg连续3个月，其体质量增长率和摄食量与空白对照组比较均未见明显差异，说明肾康汤在1.15 g～6.90 g/kg范围内对摄食量和体质量增长未见明显影响。

4.2 肾康汤对SD大鼠血液学的影响

在给药3个月(12周)的SD大鼠血液学11项指标(白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、网织红细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和凝血时间)检查结果和分析如下：

血小板数：在给药3个月后，肾康汤高、中、低剂量组与对照组比较无明显差异。恢复期肾康汤高剂量组的血小板数为883.01×10-9/L,比对照组1038.17×10-9/L明显减少(P<0.05)；中、低剂量组给药组与对照组比较无明显统计学差异。提示临床试验中注意观察停药后血小板的变化。

4.3 肾康汤给药3个月对SD大鼠血清生化的影响

给药3个月(12周)检查血清生化16项指标(钠、钾、氯、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、A/G、尿素BUN、肌酐、甘油三酯、总胆固醇、血糖、肌酸激酶)，检查结果表明：钾离子：肾康汤中剂量组大鼠的钾离子浓度为(5.02±0.42)mmol/L，比对照组(5.97±1.03)mmol/L明显降低(P<0.05)；但低、高剂量组与对照组比较未见明显差异。丙氨酸氨基转换酶(ALT): 肾康汤低、高剂量组大鼠的丙氨酸氨基转换酶为(36.17±6.89)U/L、(32.75±5.59)U/L，明显低于对照组的(43.5±7.43)U/L(P<0.01，P<0.05)，属正常波动范围；中剂量组与对照组比较无明显差异。门冬氨酸氨基转移酶(AST)：肾康汤中、高剂量组大鼠的门冬氨酸氨基转移酶为(106.0±17.66)U/L、(96.0±7.86)U/L，明显低于对照组的(129.58±27.48)U/L(P<0.05，P<0.01)，属正常波动范围；低剂量组与对照组比较无明显差异。总胆红素(TBIL)：肾康汤中剂量组大鼠的总胆红素为(2.77±0.59)μmol/L，明显高于对照组的(1.58±0.97)μmol/L(P<0.05)，属正常波动范围；低、高剂量组与对照组比较无明显差异。葡萄糖：肾康汤低剂量组的血糖为7.78 mmol/L，比对照组的5.86 mmol/L明显升高；而肾康汤高剂量组、中剂量组与空白对照均无明显差异，推测低剂量组血糖的升高可能与个别动物食量过大有关，且在停药恢复期未见升高，故推测非药物所致。肌酐(CRE)：肾康汤高剂量组大鼠的肌酐为(50.1±5.53)μmol/L，明显低于对照组的(41.92±7.32)μmol/L(P<0.01)，属正常波动范围；低、中剂量组与对照组比较无明显差异。其他项血清生化指标，给药组与对照组比较未见明显差异。

4.4 肾康汤停药恢复期血清生化检察

停止给药后2周(第14周)检查血清生化16项指标(钠、钾、氯、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、A/G、尿素BUN、肌酐、甘油三酯、总胆固醇、血糖、肌酸激酶)，结果表明：肾康汤中剂量组大鼠的葡萄糖为11.01 μmol/L，明显高于对照组的7.43 μmol/L(P<0.01)，提示临床试验中注意观察；其他血清生化指标，给药组与对照组比较未见明显差异。

4.5 肾康汤对脏器质量的影响

给药3个月，中剂量组雄性大鼠的睾丸相对质量(3.87±0.27)比对照组(3.46±0.15)明显增高(P<0.05)，提示临床试验中注意观察。

恢复期各给药组与空白对照组比较，肾康汤中剂量组睾丸相对质量(3.51±0.19)比对照组(3.70±0.02)无明显统计学差异(P>0.05)，提示的睾丸变化与药物的毒性关系不大；肾康汤低剂量组肾上腺相对质量(0.07±0.01)比对照组(0.05±0.01)明显增高(P<0.05)；肾康汤高剂量组胸腺相对质量(0.27±0.06)比对照组(0.38±0.11)明显降低(P<0.05)，提示临床试验中注意观察。其余各脏器质量均未见统计学差异。

4.5.1 肾康汤给药3个月SD大鼠脏器系数变化 肾康汤中、高剂量组(6.9 g/kg)：连续给药3个月SD大鼠心脏系数(0.30±0.04、0.30±0.04)比对照组(0.37±0.05)显著降低(P<0.01)；肺系数(0.53±0.12)、0.59±0.19)比对照组(0.65±0.12)明显降低(P<0.01)；；脾系数(0.18±0.02)比对照组(0.23±0.06)显著降低(P<0.05)；肝脏系数(2.35±0.72、2.57±0.32)比对照组(3.09±0.58)显著降低(P<0.05)；前列腺系数(0.20±0.02)比对照组(0.24±0.02)显著降低(P<0.05)；睾丸系数(0.89±0.07、0.92±0.13)比对照组(1.12±0.07)显著降低(P<0.05)；附睾系数(0.29±0.03、0.31±0.04)比对照组(0.38±0.02)显著降低(P<0.01)。中剂量组脑组织系数(0.55±0.11)比对照组(0.66±0.07)显著降低(P<0.01)。恢复期各给药组与空白对照组比较，各脏器指数均未见统计学差异，病理结果也未见损伤。提示，肾康汤中剂量组睾丸质量的变化与药物的毒性关系不大。

4.5.2 肾康汤停药2周SD大鼠脏器系数变化 肾康汤高剂量组(6.9 g/kg)：停药后2周SD大鼠胸腺质量(0.27±0.06)比对照组(0.38±0.11)显著降低(P<0.05)，同时胸腺系数(0.08±0.01)比对照组(0.10±0.02)显著降低(P<0.01)，但病理结果也未见损伤，提示肾康汤在临床用药中注意观察停药后反应。

用药3个月后，高、中剂量组可见：少数动物发生肝组织少许脂肪变性和水样变性，肝组织间质内见慢性炎细胞浸润；少数动物发生气管、支气管黏膜及肺泡轻度慢性炎症改变；个别动物淋巴结、肠黏膜、子宫颈及膀胱有炎症变化(这些改变与对照组相似，均属二级动物常见病变，与药物的毒性关系不大，恢复期未见特殊改变)。用药3个月，停药2周后高剂量组15、20号动物见灶状心肌细胞肥大，提示在临床实验中应注意观察停药后反应。

SD大鼠连续灌胃肾康汤3个月的毒性研究结果表明，肾康汤对SD大鼠主要器官和组织未见明显毒性，肾康汤在临床剂量下服用安全可靠。