虹鳟I 型干扰素IFNa 原核表达与抗病毒活性分析

杨 倩，魏文燕，汪开毓,2*，刘 韬，何晟毓，谢 恒，李良玉，刘家星

（1. 四川农业大学 鱼病研究中心，四川 成都 611130；2. 四川农业大学 动物疾病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130；3. 四川成都市农林科学院 水产研究所，四川 成都 611130）

世界鲑鱼养殖已有200 多年的历史，目前已成为仅次鲤科鱼和罗非鱼后的世界第三大主要经济养殖鱼类。我国鲑鱼养殖品种主要为虹鳟鱼（Oncorhynchusmykiss），年产量占世界总产量的1%以下，每年都需要大量进口[1]。现阶段我国正在加快开发冷水鱼资源，扩大鲑鱼的养殖范围与规模，实现鲑鱼养殖的产业化发展。然而，病毒性疾病却成为制约鲑鱼水产养殖进一步扩大的主要因素之一[2-3]。

大量研究证明了干扰素（IFN）在动物抗病毒反应中的重要性。鱼类中病毒诱导的IFN 暂且定义为Ⅰ型IFN，它们通过和哺乳动物I 型IFN 相同的Jak/STAT 信号传导途径诱导抗病毒基因的表达[4-5]。目前发现的虹鳟Ⅰ型IFN 可以细分为6 个亚组，IFNa、IFNb、IFNc、IFNd、IFNe 和IFNf[6]。IFNa 是鲑鱼中最早发现的I 型IFN[7]。研究表明，病毒感染会诱导鲑鱼IFNa 基因的大量表达，如传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）感染会增加IFNa 在TO 细胞系和鲑鱼幼鱼中的转录水平[8-9]，IFNa 可能在鲑鱼的抗病毒反应中发挥着重要作用。病毒对抗生素治疗不敏感，疫苗的研制则需要考虑病毒变异和多样性，而IFN 因其高效广谱的抗病毒活性和免疫调节活性，常作为药物被广泛的应用于临床。目前利用基因工程生产IFN已成为了获取IFN 的主要方法[10-11]。因此本研究克隆表达了具有生物活性的虹鳟IFNa，以期为后续虹鳟病毒性疾病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及主要试剂 原核表达质粒pET-32a（+）购自美国Invitrogen公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）购自TaKaRa 公司；限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ购自德国Thermo Fisher 公司；Bio-ScaleTMMini NuviaTM IMAC Ni-Charged（1×5 mL）购自美国Bio-Rad 公司。RTG-2 细胞由深圳出入境检验检疫局惠赠。

1.2 引物设计 根据GenBank 中登录的IFNa 基因（AM489418）核苷酸序列，设计PCR 引物：IFNa-F：5'-GAATTCGACTGGATCCGACACCACTAC-3'（EcoRⅠ）/IFNa-R：5'-GCTCGAGGTACATCTGTGCCGCAAGGA T-3'（XhoⅠ），预期扩增片段为453 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 虹鳟IFNa 基因的扩增及重组表达质粒的构建采用氯仿法提取虹鳟肾脏总RNA，利用Prime ScriptTMRT reagent Kit 反转录获得cDNA，并以此cDNA 为模板，利用上述引物扩增IFNa 基因。反应条件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃10 min；4 ℃结束反应。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。按照DNA 胶回收试剂盒说明书纯化目的片段，回收纯化的PCR 产物经EcoRⅠ与XhoⅠ酶切后克隆至pET-32a（+）载体中，构建重组质粒pET-32a（+）-IFNa。重组质粒pET-32a（+）-IFNa 再经单酶切（EcoRⅠ）和双酶切（EcoRⅠ和XhoⅠ）鉴定正确后-80 ℃保存备用。

1.4 重组IFNa 蛋白的表达、纯化及鉴定 将重组质粒pET-32a（+）-IFNa 转化至BL21（DE3）感受态细胞，37 ℃培养至OD600nm值约0.6，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG 诱导表达4 h。收集菌体，超声破碎细胞，离心后分别收集上清与沉淀，10%SDS-PAGE 凝胶电泳检测目的蛋白的可溶性。按照Bio-Rad 中高压层析系统操作说明进行纯化。纯化后的rIFNa 蛋白经10%SDS-PAGE 电泳后转印至PVDF 膜，以小鼠抗6×His 标 签 抗 体（1∶10 000）为 一 抗，山 羊 抗 鼠IgG-HRP（1∶8 000）为二抗，进行western blot 鉴定。最后将纯化后的rIFNa 蛋白置于PBS 缓冲液中经4 ℃低温透析复性，检测蛋白浓度，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后分装，-80 ℃存储备用。

1.5 重组IFNa 蛋白的抗病毒活性检测 将RTG-2细胞接种于24 孔细胞培养板，待铺满单层细胞后，每孔加入10 倍倍比稀释的rIFNa 蛋白孵育12 h。利用1×104pfu/mL 浓度的传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV）进行感染，每孔200 μL，细胞对照则加无病毒的营养液，同时设置pET-32a（+）空载体蛋白对照组。IHNV 感染5 d后，采用结晶紫溶液染色观察结果。

2 结果与讨论

2.1 虹鳟IFNa 基因的扩增及重组表达载体的构建利用PCR对虹鳟IFNa基因进行扩增，扩增出约400 bp的目的条带，与预期目的片段相符，初步确定为目的片段（图1）。构建的重组表达质粒pET-32a（+）-IFNa采用单酶切（EcoRⅠ）和双酶切（EcoRⅠ和XhoⅠ）进行鉴定，结果显示，EcoRⅠ单酶切得到约6 000 bp 的DNA 条带，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切得到约5 900 bp 的载体片段和约400 bp 的目的条带，与预期结果一致（图1）。测序结果显示插入基因位置与阅读框均正确。本次克隆所得虹鳟IFNa 基因序列与NCBI 中已登录的虹鳟IFNa 基因的序列存在一定差异，氨基酸序列同源性为98%，推测导致该差异的原因可能是地域性因素引起的虹鳟种质资源之间的变化。

图1 IFNa 基因的扩增及重组质粒pET-32a（+）-IFNa 的酶切鉴定Fig.1 Amplification of IFNa gene and identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-IFNa

2.2 重组IFNa 蛋白的表达、纯化及鉴定 将pET-32a（+）-IFNa 重组菌经IPTG 在37 ℃条件下诱导后进行SDS-PAGE 检测，结果显示有35 ku 的蛋白条带（图2），与预测目的蛋白加标签蛋白大小基本一致，并且能够在上清液中表达，表明该重组质粒在大肠杆菌中获得了可溶性表达。重组蛋白经纯化后进行western blot 检测，结果显示rIFNa 蛋白大小与预期相符，表明重组质粒pET-32a（+）-IFNa 能够在BL21 中正确表达。由于目前对鱼类IFN 分子方面的研究起步较晚，在测定鱼类IFN 抗病毒活性方面尚无统一规定，因此很难比较不同鱼类重组IFN 之间的活性高低。而此次表达的rIFNa 蛋白最大的优势在于获得了部分可溶性表达，由于蛋白质体外复性过程往往费时、费力，且不经济，rIFNa 蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达则具有一定的生产应用前景。

2.3 重组IFNa 蛋白的抗病毒活性检测 经检测，复性后的rIFNa 蛋白浓度约为0.5 mg/mL。采用细胞病变抑制法分析rIFNa 蛋白抗IHNV 活性，结果显示，当rIFNa 蛋白工作浓度在100 μg/mL 时才有约不到10%的细胞病变，未加rIFNa 蛋白的细胞对照孔和pET-32a（+）空载体蛋白对照孔则出现了严重细胞病变（图3）。表明pET-32a（+）编码的融合标签蛋白不具备相应的抗病毒活性，而且不影响rIFNa 蛋白本身的抗病毒活性。大量研究也证实利用pET-32a（+）载体表达的IFN 具备较好的抗病毒活性[12-14]，表明其载体上的融合标签蛋白并不影响IFN 的生物学活性。IFN效价计算一般以能保护半数细胞免受病毒侵害的最高稀释度为一个单位，当rIFNa 蛋白在0.1 μg/mL 时几乎就能保护半数的细胞免受感染，由此可知rIFNa蛋白活性约为1×104U/mg，表明原核表达的虹鳟rIFNa 蛋白具有良好的抗病毒活性。

图2 重组IFNa 蛋白表达的鉴定Fig.2 Identification of recombinant IFNa protein expression

图3 不同浓度rIFNa 体外抗IHNV 病变效应图Fig. 3 The cytopathic effect of IHNV infection antagonised by the different concentrations of rIFNa proteins

与哺乳动物中的直系同源物一样，IFN 系统的预先激活均会有效抑制鱼类病毒的复制[15-16]。本研究预先用rIFNa 蛋白刺激RTG-2 细胞12 h 后感染IHNV，结果表明rIFNa 蛋白具有较好的抗IHNV 活性，表明rIFNa 蛋白可能是一种潜在的免疫增强剂。因此，本研究结果为虹鳟基因工程IFN 制剂的生产应用奠定了一定的物质基础，也为鱼类广谱抗病毒生物制剂的研制提供了重要的参考材料。