基因Ⅶ型新城疫病毒HN 蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

霍 娜，金忠元，卫巧林，王文彬，牟素菁，李永山，陈鸿军，萧 飒*

（1. 西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；2. 中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200241）

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种高致病性禽类病毒性疾病，主要引起呼吸道、消化道和神经系统症状，是严重危害世界养禽业的烈性传染病之一[1]。根据NDV 全基因组的遗传进化分析，可以将NDV 分为ClassⅠ和Class Ⅱ两个不同类别[2]。近年来，Class Ⅱ的基因Ⅶ型病毒在欧洲、非洲、中东、南美和亚洲等地区引起了新城疫暴发，成为了主要流行的基因型[3]。

病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）具有3 种功能：受体结合、神经氨酸酶（NA）及参与融合蛋白（F）的促膜融合活性，在病毒侵入宿主细胞及其致病力中均起着关键作用[4]。此外，HN 蛋白能够诱导机体产生中和抗体，是重要的宿主保护性抗原[5]。早期研究显示HN 蛋白分子表面有7 个连续重叠的抗原位点，即位点1（aa345）、位点2（aa513、aa514、aa521、aa569）、位 点3（aa263、aa287、aa321）、位 点4（aa332、aa333、aa356）、位点12（aa494、aa516）、位点14（aa347、 aa350、 aa353）和 位 点23（aa193、aa194、aa201）[6]。其中，针对位点2、12、23 的单克隆抗体（MAb）可以抑制病毒的NA 活性，以上3 个位点及针对位点1 和14 的MAb 可以抑制病毒的HA活性，并且对病毒具有中和活性[7]。除此，位点14为线性表位，其余均为构象表位[6]。

本研究以基因Ⅶ型NDV JS/17 病毒株的HN 重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c 小鼠，制备了3 株针对HN 蛋白的特异性MAb，并对其免疫学特性及抗原表位进行了鉴定，为HN 蛋白的功能研究提供了重要工具。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 NDV 基因Ⅶ型病毒株chicken/Jiangsu/17/2006（简称：JS/17）分离于2006 年江苏省的发病鸡群。Class Ⅱ类NDV 基因Ⅱ型La Sota 株、基因Ⅵ型SX10 株和基因Ⅸ型F48E9 株及ClassⅠ类NDV QH-1 株由本实验室保存；pcDNA3-NP、pcDNA3-P、pcDNA3-M、pcDNA3-F、pcDNA3-HN 和pcDNA3-L质粒由本实验室构建；pET30a（+）载体、小鼠骨髓瘤SP2/0 细胞系、鸡成纤维细胞系DF-1 由本实验保存；HT、HAT 培养基添加剂及PEG4000 融合剂均购自美国Sigma 公司；HRP 标记羊抗鼠IgG 购自天津三箭生物技术有限公司；JS/17 株鸡多抗血清由本实验制备；AlexaFluor®594 标记的羊抗鼠IgG、FITC 标记的兔抗鸡IgY 购自英国Abcam 公司；His 标签纯化树脂和亲和层析柱购自索莱宝生物科技有限公司；MAb 亚类鉴定试剂盒购自Southern biotech 公司；6 周龄BALB/c 小鼠（20±2 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 HN蛋白的原核表达及纯化 根据JS/17病毒株的HN 蛋白结构，设计特异性扩增其胞外区（aa48～aa571）基因片段的引物，序列为F：5'-CGCGGATCC GGGGCCAGTACGCCGCACGACC-3'/R：5'-GCCCTCGA GAACTCTATCATCCTTGAGG-3'。利用TRIzol 试剂提取JS/17 病毒基因组RNA，反转录成cDNA 后作为模板，利用上述特异性引物进行PCR 扩增。胶回收目的片段克隆至pET30a（+）载体，构建原核表达质粒pET30a-HN。构建的质粒经PCR、酶切鉴定正确后由苏州金唯智公司测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG 诱导，SDS-PAGE 电泳检测HN 重组蛋白的表达情况。利用His 标签纯化HN 重组蛋白并检测纯化效果。

1.3 MAb 的制备及鉴定 以重组蛋白HN（50 μg/只）和JS/17 株活病毒（107TCID50/只）分别免疫BALB/c小鼠。免疫方案为：抗原与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后，腹腔注射；7 d 后二免，免疫途径同一免，佐剂用不完全弗氏佐剂；14 d 后三免，不加佐剂，腹腔注射。19 d 后经小鼠眼眶静脉丛采血，采用ELISA 法[8]测定多抗血清效价。对抗体滴度高的小鼠加强免疫1 次，3 d 后取阳性小鼠脾细胞与SP2/0 细胞融合。以JS/17 病毒株为检测抗原，分别采用ELISA、间接免疫荧光（IFA）和westen blot（WB）筛选阳性杂交瘤细胞。这3 种方法的一抗均为待检杂交瘤细胞上清，其中，ELISA 和WB 的二抗为羊抗鼠HRP-IgG（1∶5 000），IFA 的二抗为Alexa Fluor®594标记的羊抗鼠IgG（1∶1 000），同时设阳性对照（小鼠多抗血清）和阴性对照（SP2/0 细胞上清）。利用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆纯化，直至筛选出稳定分泌高抗体水平的单克隆细胞株，并制备小鼠腹水。具体步骤参照文献[9]进行。为明确获得的MAb 结合的NDV 蛋白，将各病毒蛋白的真核表达质粒，即pcDNA3-NP、pcDNA3-P、pcDNA3-M、pcDNA3-F、pcDNA3-HN 和pcDNA3-L 按 照Turbofect 说明书转染至BHK-21 细胞，转染30 h 后，甲醇固定细胞，以MAb（1∶2 000）为一抗，Alexa Fluor®594 标记的羊抗鼠IgG（1∶1 000）为二抗，IFA 检测MAb 与各病毒蛋白的反应性。

1.4 MAb 的生物学特性分析 分别以10 倍倍比稀释（102～107）的MAb 作为一抗，测定MAb 的ELISA、IFA、WB 和HI 效价，方法同1.3。并采用病毒中和试验（VN）测定MAb 的中和活性，步骤如下：将MAb 10 倍倍比稀释后，再按2 倍倍比稀释，分别与MOI 0.1的JS/17株震荡混匀，于37 ℃孵育2 h，接种至DF-1 细胞。感染24 h 后，甲醇固定细胞，以JS/17鸡多抗血清（1∶1 000）为一抗，FITC 标记的兔抗鸡IgY（1∶1 000）为二抗，IFA 方法检测病毒感染情况。采用软件Image 进行荧光强度的定量分析，以50%抑制病毒感染的MAb 稀释度为中和活性测定值。此外，采用MAb 亚类鉴定试剂盒对获得的MAb进行亚型鉴定，具体步骤参见试剂盒说明书。

1.5 MAb 与不同NDV 分离株的交叉反应性检测分别以La Sota、SX10、JS/17、F48E9 和QH-1 株病毒感染DF-1 细胞后，以MAb（1∶2 000）作为一抗，Alexa Fluor®594 标记的羊抗鼠IgG（1∶1 000）为二抗，采用IFA 方法检测MAb 与不同株NDV 的交叉反应性。

1.6 MAb 识别抗原表位的鉴定 根据HN 蛋白的结构，将其N 或C 端截短，即HN 蛋白的N 端（aa48 起）不变，从C 端系列截短；或保持HN 蛋白的C 端不变，从N 端系列截短。合成相应引物（表1），扩增各截短的基因片段并克隆至pET30a（+）载体。以原核表达的重组截短蛋白为检测抗原，MAb（1∶2 000）为一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）为二抗，WB 检测MAb 可能识别的表位序列。

表1 扩增HN蛋白各截短片段的引物序列Table 1 Primer sequences of each truncated fragment of HN protein

2 结 果

2.1 HN 蛋白胞外区的原核表达及纯化 PCR 鉴定和测序结果显示，HN 基因已经被正确插入到表达载体pET30a中，且方向正确阅读框完整，无碱基突变，表明已正确构建原核表达重组质粒pET30a-HN。将重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG 诱导，SDS-PAGE 电泳检测HN 重组蛋白的表达。结果显示，在70 ku处出现目的条带，与预期一致（图1）。该重组蛋白以包涵体形式存在，经His 纯化，其纯度约为70%，浓度为0.64 mg/mL。表明获得了重组HN 蛋白。

图1 重组HN 蛋白表达的SDS-PAGE 检测结果Fig.1 Detection results of recombinant protein pET30a-HN expression

2.2 MAb 的制备与鉴定结果 以原核表达的重组HN 蛋白为免疫原，经ELISA、IFA 和WB 筛选获得1株特异性MAb，命名为2G8。以JS/17株活病毒为免疫原，经ELISA、IFA 和WB 筛选获得2 株特异性MAb，分别命名为1D4 和4D9。1D4 和4D9 与转染NDV 的各病毒蛋白质粒pcDNA3-NP、pcDNA3-P、pcDNA3-M、pcDNA3-F、pcDNA3-HN 和pcDNA3-L 的BHK-21 细胞进行IFA检测，结果显示：2G8、1D4和4D9均能与pcDNA3-HN质粒转染的细胞反应，胞浆和细胞膜呈现红色荧光，而与其它质粒转染的细胞无反应（图2），表明MAb 2G8、1D4 和4D9 均特异性结合HN 蛋白。

2.3 MAb 的生物学特性测定结果 采用ELISA、IFA、HI、WB 和VN 方法测定MAb 2G8、1D4 和4D9的效价。结果显示，2G8 的ELISA 和IFA 效价均可达104，WB 效价可达1∶2 000，无HI 效价也无中和活性；1D4 和4D9 的IFA 效价可达105，HI 效价可达214，无WB 和ELISA 效价，二者均能够中和JS/17 株病毒，中和效价为1280。表明MAb 2G8 能识别HN蛋白的线性抗原表位，无病毒中和活性，而MAb 1D4 和4D9 识别抗原的构象表位并具有血凝抑制及病毒中和活性。MAb 亚类鉴定试剂盒结果显示2G8 的重链为IgG1 亚类，轻链为kappa 链。由于MAb 1D4和4D9 无法用于ELISA 和WB 检测，所以未得到亚类鉴定结果。

2.4 MAb 与不同病毒的交叉反应性试验结果 采用IFA 方法检测该3 株MAb 与不同NDV 的反应性。结果显示：2G8 与所有受试病毒株均反应，而1D4和4D9 与Class II 类的La Sota、SX10、F48E9 病毒株发生特异性反应，与ClassⅠ类HQ-1 株不反应（图3）。表明MAb 2G8 可识别ClassⅠ和ClassⅡNDV，MAb 1D4 和4D9 仅识别ClassⅡNDV，而不能识别ClassⅠNDV。

图2 MAb 的IFA 检测结果（200×）Fig.2 Identification of MAb by IFA(200×)

图3 MAb 与不同NDV 交叉反应性检测结果（100×）Fig.3 Results of cross-reactivity of the MAb among different NDV strains(100×)

2.5 MAb 2G8 识别HN 抗原表位的鉴定结果 为了明确MAb 2G8 识别HN 的具体线性表位位点，本研究利用原核表达HN 蛋白的不同截短体及WB 方法对其抗原表位进行鉴定。首先，从HN 蛋白C 端截短，经原核表达的4 个截短蛋白均能够与MAb 2G8反应（图4A、4D）。表明2G8 识别的抗原区域位于aa48～aa228；再从HN 蛋白的N 端截短，WB 结果显示，2G8 仅与aa123～aa571 截短体蛋白特异性结合（图4B、4E）。表明MAb 2G8 识别的抗原区域位于aa123～aa165。继续截短该区域，经WB 结果显示，MAb 2G8 仅与aa131～aa571 截短蛋白特异性结合（图4C、4F）。结果表明：MAb 2G8识别HN蛋白的aa131～aa139，其序列为131DYIGGIGKE139。比对分析Gen-Bank 登录的353 株不同病毒的HN 蛋白氨基酸序列，显示表位131DYIGGIGKE139在不同的病毒株中均高度保守，仅有极个别病毒株存在氨基酸差异（表2）。表明，MAb 2G8 识别HN 蛋白高度保守的线性抗原表位131DYIGGIGKE139。

图4 HN 截短体原核表达（A、B、C）和MAb 2G8 抗原表位鉴定结果（D、E、F）Fig.4 Prokaryotic expression of different HN truncated proteins(A,B,C)and epitope identification of MAb 2G8(D,E,F)

表2 MAb 2G8 识别的抗原表位在部分NDV 病毒株间的序列比对结果Table 2 Comparison of the epitope recognized by the MAb 2G8 among the different strains of NDV

3 讨 论

原核表达系统具有操作简单、耗时短、成本低、产量高的特点。所以，本研究利用该系统表达HN 蛋白作为免疫原进行MAb 的制备。由于HN 蛋白是糖基化囊膜蛋白，原核表达的蛋白缺乏翻译后修饰，影响蛋白的生物学活性。因此，本研究同时采用JS/17 株活病毒为免疫原进行MAb 制备，该方法可以保留HN 蛋白的天然结构和生物学活性，以获得更具功能性的HN MAb。

目前，已经鉴定出NDV HN 蛋白的7 个重叠抗原位点中仅存在一个线性表位，即位点14（aa345～aa353），针对该位点的MAb 可以抑制病毒的NA 和HA 活性，其余抗原表位均为构象表位[6-7]。此外，Li等使用酵母表面展示系统将NDV HN 蛋白划分为4 个线性抗原区域：P1（aa2～aa52）、P2（aa5～aa192）、P3（aa193～aa303）和P4（aa304～aa571）。利用构建的真核表达质粒pVAX-P1、pVAX-P2、pVAX-P3 和pVAXP4 免疫鸡攻毒后，仅pVAX-P2 免疫组有60%的SPF鸡存活，其余3 个免疫组的SPF 鸡均死亡。表明P2是HN 蛋白的保护性抗原区[10]。但是，中和位点14位于P4 抗原区域内，而pVAX-P4 未对SPF 鸡表现出保护性，具体原因有待进一步探究。本研究获得的MAb 2G8 识别线性表位为131DYIGGIGKE139，其在各NDV 病毒株中均高度保守。该表位位于P2 抗原区域内，但无HI 及病毒中和活性。

有研究表明完全中和NDV 需要HN 蛋白中4 个不同中和位点的MAb 协同作用，才可使其中和水平与多抗血清相当[11]。本研究结果显示：以JS/17 株全病毒为免疫原获得的MAb 1D4和4D9具有较好的中和活性，但无法完全中和病毒的感染，推测HN 蛋白存在不止一个抗原中和位点。其次，MAb 1D4 和4D9同时具有较好的血凝抑制作用，有研究显示HN 蛋白的受体识别位点与抗原位点存在部分重叠[12]，由此推测HN 蛋白的中和活性与HA 活性紧密相关，即MAb 与HN 蛋白结合，阻碍了HN 结合细胞表面的唾液酸受体，抑制了病毒对细胞的感染。此外，有研究报道通过IFA 方法鉴定的HN MAb 2H7 能够识别基因Ⅵ、Ⅶ及Ⅸ型病毒株，但不与基因I、Ⅱ型及Class I 病毒株反应[13]。针对ClassⅠ病毒株的HNMAb3H7 和3H9 仅识别ClassⅠ病毒株，而不与ClassⅡ病毒株反应[14]。本研究获得的MAb 1D4 和4D9 与Class Ⅱ的基因Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型病毒株均可以发生特异性结合，但不识别ClassⅠ病毒株，表明该两株MAb 具有鉴别ClassⅠ和ClassⅡNDV 的潜力，未来需增加病毒株尤其是ClassⅠ病毒株的数量以验证该两株单MAb 的鉴别能力是否具有广泛适用性。本研究制备的3 株MAb 为进一步研究HN 蛋白的功能及对NDV 的鉴定提供了物质基础。