含1,2,3-三氮唑基团的新型四氧杂杯[2]芳烃[2]嘧啶衍生物的合成与抗肿瘤活性研究

吴 鑫, 余永波, 安 琳, 黄统辉

(徐州医科大学 江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221000)

癌症是全球死亡率较高的疾病，随着人口老龄化加剧，发病率持续升高[1-2]。近年来，尽管大量新型抗癌药物应用于临床治，但由于癌症多样性及耐药性的出现，死亡率仍然很高。因此，开发安全有效的新型抗癌药物仍然是目前医学领域研究的热点问题。

Scheme 1

杯芳烃是一类具有独特空腔结构的环状低聚物[3]，广泛应用于分子识别[4]、药物载体[5]、抗菌[6]、抗肿瘤[7-8]等领域。其中，杂环杯芳烃由于杂原子及杂芳环的引入，可以更有效地调节空腔大小及电子密度[9-10]，一系列具有较好抗肿瘤活性的杂环杯芳烃被报道[11-12]。嘧啶氧基苯基与1,2,3-三氮唑是重要的杂环结构片段，两者的衍生物均具有良好的理化性质及抗炎[13-14]、抗菌[15-16]、抗肿瘤[17-18]等生物活性。鉴于此，本课题组根据药效团和骨架跃迁原理，将具有潜在抗肿瘤活性的嘧啶氧基苯基片段引入杯芳烃骨架中，并利用点击化学反应在于侧链引入活性基团1,2,3-三氮唑，设计、合成了一系列结构新颖的、包含多潜在抗肿瘤活性官能团的含1,2,3-三氮唑基团的四氧杂杯[2]芳烃[2]嘧啶衍生物。

本文以4-氯-2-甲硫基-6-丙炔氧基嘧啶为原料，依次经Williamson醚合成、氧化和聚合反应制得新型四氧杂杯[2]芳烃[2]嘧啶母体(4)，并通过点击化学反应合成了4个结构新颖的含1,2,3-三氮唑基团的四氧杂杯[2]芳烃[2]嘧啶衍生物(5a～5d, Scheme 1)，其结构经1H MNR，13C MNR和HR-MS(ESI)表征并用MTT法验证了5a～5d对人宫颈癌细胞(Hela)，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞(A549)的体外抗肿瘤活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

YRT-3型熔点仪；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪；JNM-ECZR 400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6或CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Bruker maXis 4G UHR-TOF型质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 中间体2的合成

在500 mL的茄形瓶中加入间苯二酚3.30 g(30.0 mmol)， 3,5-二羟基苯甲酸甲酯5.04 g(30.0 mmol)，碳酸铯14.43 g(44.4 mmol)和乙腈300 mL，室温搅拌30 min，随后加入112.96 g(60.0 mmol)，移至75 ℃油浴中反应48 h(TLC跟踪反应至结束)。冷却，抽滤，干燥脱溶，粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂:A=石油醚/乙酸乙酯5/1,V/V)纯化得白色固体2，收率43%, m.p.122.5～128.2 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.76(d,J=2.2 Hz, 2H), 7.23～7.19(m, 1H), 6.44(s, 2H), 5.10(d,J=2.3 Hz, 4H), 3.91(d,J=3.6 Hz, 3H), 3.18(s, 6H), 2.56(t,J=2.4 Hz, 2H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 171.5, 170.6, 164.9, 164.8, 152.8, 133.3, 120.4, 119.5, 95.0, 76.9, 76.4, 56.0, 52.9, 38.9; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C24H21N4O6S2{[M+H]+}525.1, found 525.1。

(2) 中间体3的合成

将中间体22.33 g(5.0 mmol)溶于80 mL二氯甲烷中，分批次加入m-CPBA 2.85 g(15 mmol)，氩气保护下常温反应5 h(TLC跟踪反应至结束)。抽滤，脱溶，粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂:A=2/1)纯化得中间体白色固体3，收率85%, m.p.116.5～118.7 ℃;1H NMR(DMSO, 400 MHz)δ: 7.83～7.71(m, 3H), 6.84(d,J=2.5 Hz, 2H), 5.14～5.11(m, 4H), 3.83(d,J=2.2 Hz, 3H), 3.72～3.64(m, 2H), 3.25(d,J=2.3 Hz, 6H);13C NMR(DMSO, 100 MHz)δ: 171.5, 170.6, 164.9, 164.8, 152.8, 133.3, 120.4, 119.5, 95.0, 76.9, 76.4, 56.0, 52.9, 38.9; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C24H20N4O10S2{[M+Na]+}611.0531, found 611.0448。

(3) 中间体4的合成

在500 mL的茄形瓶中加入间苯二酚1.32 g(12.0 mmol)， 3,5-二羟基苯甲酸甲酯2.17 g(12.0 mmol)，碳酸铯7.8 g(24 mmol)，乙腈300 mL。室温搅拌30 min后，加入中间体36.36 g(12.0 mmol)，移至75 ℃油浴中反应3 h(TLC跟踪反应至结束)。冷却，抽滤，脱溶，粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂:A=1/1)纯化得白色固体4，收率37%, m.p.85.4～87.6 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.47(d,J=2.1 Hz, 2H), 7.41(d,J=2.1 Hz, 2H), 6.89～6.86(m, 1H), 6.78～6.75(m, 1H), 6.13(s, 1H), 5.07(d,J=2.4 Hz, 4H), 3.87(d,J=0.8 Hz, 6H), 2.58(t,J=2.3 Hz, 2H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 172.5, 171.7, 165.4, 164.1, 152.9, 132.3, 121.6, 120.8, 86.7, 77.7, 75.7, 54.9, 52.5; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C30H21N4O10{[M+H]+}597.1, found 597.1。

(4) 化合物5a～5d的合成(以5a为例)

将4-(3-叠氮丙氧基)吡啶0.125 g(0.55 mmol)和中间体40.149 g(0.25 mmol)溶于10 mL DMF，加入催化剂CuSO4·5H2O 0.030 g(0.10 mmol)和抗坏血酸钠0.050 g(0.25 mmol)，90 ℃下反应2 h(TLC跟踪反应至结束)。冷却，加水析出固体，抽滤，粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂:A=2/1)纯化得目标化合物5a。

5a: 黄色固体，收率21%, m.p.125.4～127.1 ℃;1H NMR(DMSO, 400 MHz)δ: 8.27(s, 2H), 7.65(d,J=7.6 Hz, 4H), 7.37(d,J=2.2 Hz, 2H), 7.32(d,J=2.2 Hz, 2H), 7.26(t,J=2.2 Hz, 1H), 7.17(t,J=2.2 Hz, 1H), 6.36(s, 2H), 6.08(d,J=7.6 Hz, 4H), 5.47(s, 4H), 4.38(t,J=7.0 Hz, 4H), 3.89(t,J=7.0 Hz, 4H), 3.76(d,J=5.0 Hz, 6H), 2.34～2.20(m, 4H);13C NMR(DMSO, 100 MHz)δ: 177.5, 173.3, 171.6, 165.1, 165.0, 164.0, 153.6, 153.4, 142.3, 141.5, 125.7, 120.1, 118.0, 87.1, 60.7, 53.3, 53.0, 47.1, 31.2; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C46H40N12O12{[M+H]+}953.2961, found 953.2966。

5b: 白色固体，收率10%, m.p.133.0～135.4 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.96(s, 2H), 7.60(d,J=9.5 Hz, 2H), 7.43(d,J=1.8 Hz, 2H), 7.37(d,J=1.9 Hz, 2H), 7.34(d,J=8.4 Hz, 2H), 6.86～6.69(m, 6H), 6.26(d,J=9.5 Hz, 2H), 6.06(s, 2H), 5.59(s, 4H), 4.84(t,J=4.5 Hz, 4H), 4.46(t,J=4.6 Hz, 4H), 3.86(d,J=2.8 Hz, 6H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 173.1, 171.6, 165.3, 164.1, 161.0, 160.8, 155.8, 153.0, 152.9, 143.3, 143.1, 129.2, 125.3, 121.6, 120.7, 113.9, 113.4, 112.6, 101.7, 86.7, 66.8, 60.3, 52.5, 49.6; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C52H38N10O16{[M+H]+}1059.254 0, found 1059.252 5。

5c: 白色固体，收率17.6%, m.p.116.3～118.7 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.78(s, 2H), 8.04(t,J=8.2 Hz, 4H), 7.98(s, 2H), 7.46～7.43(m, 2H), 7.41～7.33(m, 6H), 7.04(s, 2H), 6.83(dd,J=3.5 Hz,J=2.0 Hz, 1H), 6.74(dd,J=3.6 Hz,J=2.0 Hz, 1H), 6.04(d,J=1.5 Hz, 2H), 5.58(s, 4H), 4.87(t,J=4.7 Hz, 4H), 4.52(t,J=4.7 Hz, 4H), 3.85(s, 6H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 173.1, 171.6, 165.3, 164.1, 156.0, 153.0, 152.9, 148.2, 144.2, 143.1, 135.4, 131.0, 129.2, 125.3, 122.2, 121.7, 121.6, 120.7, 106.6, 86.7, 66.7, 60.3, 52.5, 49.8; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C52H40N12O12{[M+H]+}1025.2961, found 1025.2972。

5d: 黄色固体，收率11.2%, m.p.142.6～145.1 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.07(d,J=7.0 Hz, 2H), 8.00(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.74～7.65(m, 2H), 7.54(s, 2H), 7.49(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.40(d,J=2.1 Hz, 4H), 7.37～7.29(m, 2H), 6.76～6.68(m, 2H), 6.48(d,J=7.1 Hz, 2H), 5.95(s, 2H), 5.41(s, 4H), 4.79(t,J=5.8 Hz, 4H), 4.44(t,J=5.8 Hz, 4H), 3.88(d,J=2.7 Hz, 6H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 172.9, 171.5, 168.2, 165.3, 164.0, 152.9, 143.0, 138.5, 132.3, 131.4, 129.2, 128.9, 128.6, 125.8, 125.2, 125.0, 124.7, 120.8, 120.7, 104.7, 86.6, 60.1, 52.5, 49.2, 42.1, 41.0; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C56H40N12O12{[M+H]+}1073.2961, found 1073.2980。

1.2 性能或活性测试

采用MTT法研究化合物5a～5d对MCF-7、 HepG2、 A549、 HeLa的体外抗增殖活性。以5-氟尿嘧啶为阳性对照，测试目标化合物的单浓度抑制率。设定给药浓度为50 μM，作用时间为72 h，每组设6个复孔[19-20]。

2 结果与讨论

2.1 合成

合成3的过程中发现，间氯过氧苯甲酸需分批次加入，否则反应过于剧烈，影响收率。在以中间体4合成目标化合物5a～5d的过程中，探索了不同的催化剂、溶剂、反应温度、反应时间对收率的影响。结果表明，单独使用CuI或抗坏血酸钠作为催化剂时，收率显著低于使用CuSO4·5H2O与抗坏血酸钠的收率；在DMF、 PEG-600、 DMSO、 THF等多种溶剂中，以DMF作为溶剂时收率最高；反应最佳温度为90 ℃，反应温度降低时，收率随之降低；反应温度升高时，TLC检测反应杂质增多，收率亦降低；反应2 h原料基本反应完全，延长反应时间至4 h，反应杂质增多，收率降低。

2.2 抗肿瘤活性

表1为化合物5a～5d对Hela、 MCF-7、 HegG2和A549的体外抗肿瘤活性及其油水分配系数LogP值。由表1可见，化合物5a～5d对肿瘤细胞显示出不同程度的抗增殖作用。其中，化合物5a对肿瘤细胞有明显的抑制作用，其在50 μM浓度下对MCF-7的抑制率可达82%，是阳性对照药5-氟尿嘧啶的2.6倍；对A549的抑制率为53.9%，略低于5-氟尿嘧啶(5-FU)；对Hela和HegG2的细胞毒性较差，显示出一定的选择性。化合物5b～5d的抗肿瘤活性相对较弱，其中化合物5d表现出最弱的抗增殖活性，可能与其较高的亲脂性有关(LogP=9.58)。基于此，推测此类化合物的抗肿瘤活性可能与亲脂性有关，当引入基团亲脂性过高时，化合物溶解性差，抗肿瘤活性降低。因此，后续的优化将集中在引入水溶性基团以改善其油水分配系数，提升抗肿瘤活性方面。

表1 5a～5d的构效关系

a5a～5d的浓度为50 μM；bLogP值由Molsoft软件计算。

以4-氯-2-甲硫基-6-丙炔氧基嘧啶为原料，设计并合成了4个结构新颖的含1,2,3-三氮唑基团的四氧杂杯[2]芳烃[2]嘧啶衍生物(5a～5d)，并采用MTT法初步评价了其体外抗肿瘤活性。结果表明，化合物5a对MCF-7具有明显的抑制活性，在50 μM浓度下抑制率可达82%，优于阳性对照药5-氟尿嘧啶，具有潜在的临床价值。进一步的结构优化与生物活性研究正在进行中。