烟碱手性异构体的分离分析

2020-06-04聂海英黄志萍

云南化工 2020年1期

杨强，张箭，聂海英，黄志萍，李江

（1.湖北和诺生物工程股份有限公司，湖北恩施 445000；2.湖北航天化学技术研究所，湖北襄樊 441003）

手性药物是指具有相同的分子结构、物理性质和化学组成，但立体结构互为镜像的一类药物的总称。烟碱是一种吡啶型生物碱，是重要的医药、化工原料，主要存在于烟草中，可用作高效低毒的天然杀虫剂，也是治疗老年痴呆症、帕金森症、抑郁症的有效药物。天然烟碱是R（-）左旋手性分子，一般从烟草下脚料中提取而得[1-2]。而人工合成的烟碱大多数是左、右旋异构体等量的外消旋烟碱。右旋烟碱与左旋烟碱具有同样的生理作用，并具有更低的生物毒性。因而有人利用手性原料和选择性反应合成右旋烟碱，也有人合成外消旋烟碱，并利用烟碱左、右旋异构体生成有机酸盐晶体的溶解性差异对异构体进行分离[3-5]。

烟碱分析一般采用气相色谱法和液相色谱法[6-7]，美国药典和欧洲药典中天然烟碱的分离分析也采用气相色谱法和液相色谱法[8-9]。也有人通过固相/液相微萃取、分子印迹材料对样品进行前处理纯化后，再采用紫外分光光度法、气相色谱法和液相色谱法进行分析，但上述方法不能分离烟碱手性异构体[10]。β-环糊精分子中含有7个（奇数）葡萄糖单元,这种非对称结构使其对大多数手性成分具有区分能力。刘百战[11]用DB-1柱，一根全甲基化β-环糊精手性柱，采用二维气相色谱法成功分离了烟碱手性异构体，R（+）尼古丁（烟碱）的检测限约为0.5%。但该法手性柱如果初温低于50℃，时间大于15min，全甲基化环糊精固定相开始固化，会导致手性分离能力显著下降。因此，当初温低于50℃时，要先把柱温提高，使环糊精衍生物液化，然后再降到低温，立即开始样品分析。由于外消旋烟碱多采用有机酸盐的方式进行分离，烟碱盐易溶于水，在气相色谱中较难气化，故本文采用反相液相色谱手性柱分离分析烟碱手性异构体，建立烟碱手性异构体灵敏、准确、简单、快速的分离分析方法，以便于在分离外消旋烟碱时评价其分离效果。

1 实验部分

1.1 仪器及实验条件

高效液相色谱（HPLC）仪，美国安捷伦（Agilent，USA）公司1260 infinity型，配备二极管阵列紫外检测器，检测波长260 nm。色谱柱：CHIRALPAK IG-3，粒径 3μm，Φ4.6mm×250mm，大赛璐（DAICEL）（中国）投资公司。流动相:70%20 mmol/L碳酸氢铵水溶液+30%乙腈；流速：0.5mL/min。样品用流动相溶解，浓度为0.0005～0.005g/mL，进样量 2μL。

10mL，25 mL容量瓶若干，5 mL刻度移液管一支。

1.2 试剂与材料

天然左旋烟碱，湖北和诺生物工程股份有限公司生产；外消旋烟碱，烟碱有机酸盐，湖北航天化学技术研究所制备；乙腈，色谱纯，迪马科技公司；碳酸氢铵，分析纯，西陇科学股份有限公司；实验用水符合GB/T 6682中一级水要求。

1.3 标准溶液的配制

采用高纯度天然烟碱作为标准样品，纯度用气相色谱归一法检测在99.5%以上，样品用流动相溶解，质量浓度为0.0001～0.01 g/mL。

2 结果与讨论

2.1 实验条件选择

2.1.1 色谱分离方法选择

1）GC法，不同极性毛细管色谱柱；

2）HPLC法，正相和C18、NH2反相色谱柱；

3）HPLC法，采用手性柱。

采用方法1）和2），天然左旋烟碱和外消旋烟碱均只有一个峰，且保留时间相同，无法分离手性异构体，而方法3，可以将左旋和右旋烟碱异构体分开。因而采用HPLC法手性柱进行分析。

2.1.2 色谱柱与流动相选择

2.1.2.1 色谱柱

由于烟碱及其盐易溶于水，选择反相色谱条件。大赛璐的色谱柱CHIRALPAK IG-3为多糖衍生物硅胶涂敷型手性反相色谱柱，柱效较为稳定，且可分离烟碱异构体，故选择大赛璐CHIRALPAK IG-3手性色谱柱。

2.1.2.2 流动相

由于烟碱为弱碱性，选用碳酸氢铵水溶液作为流动相，烟碱可以保持在 pH为9～10的碱性环境中，可以抑制烟碱上碱性的氨基基团的离子化，烟碱不易水解成离子，避免缩短保留时间，降低分辨率；保持烟碱分子状态，可确保保留时间较长，提高分辨率。选择20 mmol/L碳酸氢铵水溶液90%～50%，乙腈10%～50%范围进行实验。结果表明：流动相为70%碳酸氢铵水溶液，30%乙腈时，烟碱色谱出峰时间合适，不仅左旋和右旋异构体可以分开，而且可以与杂质进行有效分离，通过天然烟碱定性，确定左、右旋烟碱出峰位置，如图1所示。图1中还可看出，不同烟碱盐中左右旋含量不同：结晶的（s）酒石酸烟碱盐（Nicotine tartrate）左旋体右旋体大于50%；未结晶的（l）L-对甲二苯甲酰酒石酸烟碱盐（Nicotine-O,O’-di-p-toluoyl-L-tartrate，L-PTT）右旋体大于50%，说明可以通过烟碱盐结晶性和溶解性的不同来分离烟碱手性异构体。

图1 典型烟碱（盐）样品色谱分离图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围和检出限

以高纯左旋烟碱为标准品，用纯水配制浓度范围为0.0001～0.01 g/mL标准溶液，以峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x，g/mL）绘制标准曲线（见图2）。结果表明，标准曲线具有良好的线性关系，相关系数（R2）为0.999。以信噪比为3和10时的进样浓度为最低检出含量和最低定量含量，最终计算得出该方法的检出限为 9.3×10-8g/mL，定量限为 1.4×10-8g/mL。

2.2.2 方法准确度

由于外消旋烟碱手性异构体结构对称，其紫外特征峰和吸收强度与天然左旋烟碱一致（见图3），烟碱左右旋异构体的响应因子为1.01，可以用高纯天然左旋烟碱作为标准品，采用外标法进行定量，也可用归一化法对手性异构体相对含量进行定量。方法准确度通过在一批已测含量的消旋烟碱样品中加入左旋烟碱，测定其回收率进行验证，结果见表1。结果表明，左旋异构体的加标回收率为 95.2%～103.8%，相对标准偏差为3.9%，平均回收率为99.4%，准确度较好。

2.2.3 方法精密度

图2 标准曲线

图3 不同烟碱紫外特征吸收谱图

表1 HPLC测定烟碱手性异构体方法准确度Table 1 The accuracy of the methods for quantitative analysis of Nicotine chiral isomers by HPLC

对同一批外消旋烟碱进行测定，结果见表2。结果表明，手性异构体标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD）均小于0.5%，方法精密度较好。

2.3 方法实用性

用不同有机酸与外消旋烟碱反应生成的盐样品进行了检测，结果见表3。从表3中看出，不同相态烟碱盐中左右旋烟碱含量有明显差别：如结晶的酒石酸烟碱盐（Nicotine tartrate（s））左旋烟碱达到89%，而液态未结晶的L-PTT（l）、未结晶的5磺基水杨酸烟碱盐（Nicotine 5-sulfosalicylate dihydrate（l））右旋烟碱分别为61.60%、55.73%，大于50%，说明不同有机酸烟碱盐结晶性明显不同，可以通过重结晶分离左右旋烟碱。检测结果可以区别样品的分离效果，实用性较好。