玉木耳转录组测序及褐变相关基因的挖掘

杨和川，苏文英，谭一罗，周振玲，秦裕营，李 晓

(1.江苏省连云港市农业科学院,江苏 连云港 222006；2.吉林农业大学 食药用菌教育部工程中心,吉林 长春 130118)

玉木耳,是毛木耳(Auriculariacornea)的白色变种[1]。色泽是衡量玉木耳商品价值的重要指标之一,理想的商品玉木耳要求采摘后外形好、颜色洁白。然而玉木耳有一个大的缺陷,采收后的玉木耳如果晾晒不及时,则极易发生褐变。玉木耳一旦褐变,则被视为鲜度下降,严重影响玉木耳的食用价值和商品价值。研究表明,在食用菌中催化子实体褐变过程的主要酶类为多酚氧化酶(PPOs)和氧化酶类,多酚氧化酶主要是指酪氨酸酶、双酚氧化酶、漆酶等[2]。目前,对双孢蘑菇组织褐变的研究表明,多酚氧化酶是其发生酶促褐变的主要原因[3]。此外,也有研究表明漆酶基因在香菇黑色素形成过程中发挥重要作用[2]。近年来,利用分子生物学技术对食用菌组织褐变机制的研究越来越多。因此,利用转录组测序技术和生物信息学方法,从转录组水平比较不同材料的转录谱差异,解析玉木耳褐变的代谢途径和信号转导等调控机制,发掘、鉴定和克隆关键节点的功能基因/调控元件,对食用菌抗褐变分子育种具有重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本项目组于2018年6月14日在连云港市锦屏镇玉木耳种植大棚内发现同一批制种栽培、同一生长环境下的玉木耳子实体有一部分发生了褐变，因此将未褐变的子实体作为对照组,将褐变的子实体作为实验组从成熟菌袋摘取,立即存入液氮中,运回实验室后保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 总RNA的提取、cDNA文库构建及转录组测序

按TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书提取总RNA,通过浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA是否有污染及降解;利用Nanodrop检测RNA的纯度(以OD260/OD280≥1.8为标准);应用自动生物分析系统Agilent 2100精确检测待测序样品RNA的完整性。在样品检测合格后进行cDNA文库构建及RNA-Seq转录组测序(由北京诺禾致源科技股份有限公司完成)。

1.3 序列组装

将测序获得的原始数据(Raw reads)中含有带接头的、重复的和测序质量很低的Reads过滤,得到高质量的Clean reads。采用Trinity对Clean reads进行拼接,通过Corset层次聚类得到最长的Cluster序列，进行后续的分析。

1.4 基因注释

为了获得全面的基因功能信息,将组装获得的Unigene序列与七大数据库(NR、NT、KOG、Swiss-Prot、KO、GO、PFAM)进行比对(evalue<0.00001),获得功能注释。

1.5 差异表达基因分析

使用FPKM (Fragments per kb per million fragments)法表示Unigene表达量[4]。采用DESeq2[5]进行基因差异表达分析,筛选阈值为padj<0.05且|log2FoldChange|>1。然后,通过对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析,筛选与玉木耳子实体褐变相关的差异表达基因 。

1.6 qRT-PCR验证测序结果

随机选择测序筛选得到的7个表达显著差异的基因,进行qRT-PCR验证分析,所用引物通过Primer Primer 5软件设计(表1)。以褐变前、后的玉木耳子实体RNA为模板,反转录获得cDNA, 以ACTIN基因为内参基因。采用SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit (TaKaRa)荧光定量试剂盒在ABI StepOne Plus型荧光定量PCR仪上进行荧光定量检测。扩增条件:95 ℃ 30 s,循环1次;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,循环40次；72 ℃单点检测信号。每个样品设3 次技术重复,采用 2-△△Ct法对各基因进行相对定量分析。

表1 qRT-PCR的引物

2 结果与分析

2.1 转录组测序数据组装及统计

通过对未褐变及褐变玉木耳子实体转录组进行转录组测序,共获得Clean Bases 30.26 G, Q30碱基百分比在92%以上,G、C含量在62%以上(表2),可以用于下一步组装。利用Trinity 组装后共获得128120条Unigene序列,总长度为173216508个核苷酸,平均长度为957 bp,N50 长度为1834 bp。Unigene的序列长度主要分布在200～2000 bp;其中500～2000 bp间的序列数量较多,约占全部序列的64.6%,表明获得的测序数据及组装质量可靠性较高,可以进行后续分析(图1)。

表2 样品测序数据评估统计结果

图1 玉木耳Unigene长度分布

2.2 转录组Unigene的功能注释

将获得的Unigene分别注释到NR (NCBI non-redundant protein sequences)、NT (NCBI nucleotide sequences)、PFam (Protein family)、KOG(euKaryotic Ortholog Groups)、COG (Cluster of orthologous groups)、Swiss-Prot (Swiss-Prot protein database)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、GO (Gene Ontology)。结果显示,有50.7%的Unigene可以获得功能注释(表3)。其中,64.75%的Unigene被注释到NR数据库中。而在注释类别中, KEGG的注释量为33832条,占总注释的26.4%。

表3 功能注释结果统计

2.3 Unigene的功能注释和分类

通过对获得的78979个Unigene基因进行GO功能显著性富集分析,发现总共涉及56种生物功能,分别划分为生物学过程、细胞组分和分子功能。这3类功能可分别进一步细化为26、20和10个亚类(图2)。在生物学过程中,占比最多的Unigene为参与细胞过程和代谢过程,分别占59.2% (46742个)和56.5% (44593个)；此外,单一有机体也属于显著富集的类型,共包含34277个Unigene,占比为43.4% (图2)。在细胞组分分类中,细胞和细胞组分类型中的Unigene最多,占33.6% (26513个)；细胞器和大分子复合体次之,占比分别为24.1% (19051个)和23.5%(18566个) (图2)。在分子功能分类中,占比较高的Unigene为结合作用和催化活性,分别占57.2% (45174个)和46.0% (36307个);最后是结构分子活性和转运活性,所占比例分别为7.7% (6107个) 和7.3%(5775个)(图2)。

对33832个Unigene基因进行KEGG Pathway富集分析,结果表明33832个Unigene比对到32条信号通路。显著富集KEGG途径可分为5类,这5类途径包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢以及有机系统。其中,最主要的信号通路为翻译通路,共有8217个Unigene参与,约占Unigene总量的24.3%;其次,4409个Unigene参与信号转导途径,所占比例为13.0%;再次,分别为内分泌系统、折叠排序及退化、运输和分解代谢通路等(图2)。

2.4 差异表达基因KEGG富集分析

对筛选获得的差异表达基因进行统计分析,结果发现共存在5915个差异基因,其中有924个Unigene上调表达,有4991个Unigene下调表达。将差异表达基因与KEGG数据库进行比对,有2587条差异基因得到注释,富集在99条KEGG代谢通路中。富集最多的KEGG通路为核糖体、内质网蛋白加工、吞噬体等(图3),其中注释为核糖体的差异表达基因数量最多,为683个,占代谢通路中全部差异表达基因数的11.54%,其中上调表达基因589个,下调表达基因94个。在99个代谢通路中,推测酪氨酸代谢途径(ko00350)可能与玉木耳组织褐变相关。络氨酸代谢途径中酪氨酸酶基因Cluster-50942.40979 [TYR, tyrosinase (EC:1.14.18.1)]在食用菌组织褐变中发挥重要作用。

1. behavior; 2. biological adhesion; 3. biological phase; 4. biological regulation; 5. cell aggregation; 6. cell killing; 7. cellular component organization or biogenesis; 8. cellular process; 9. detoxification; 10. developmental process; 11. growth; 12. immune system process; 13. localization; 14. locomotion; 15. metabolic process; 16. multi-organism process; 17. multicellular organismal process; 18. negative regulation of biological process; 19. positive regulation of biological process; 20. regulation of biological process; 21. reproduction; 22. reproductive process; 23. response to stimulus; 24. rhythmic process; 25. signaling; 26. single-organism process; 27. cell; 28. cell junction; 29. cell part; 30. extracellular matrix; 31. extracellular matrix component; 32. extracellular region; 33. extracellular region part; 34. macromolecular complex; 35. membrane; 36. membrane part; 37. membrane-enclosed lumen; 38. nucleoid; 39. organelle; 40. organelle part; 41. other organism; 42. other organism part; 43. synapse; 44. synapse part; 45. virion; 46. virion part; 47. antioxidant activity; 48. binding; 49. catalytic activity; 50. metallochaperone activity; 51. molecular function regulator; 52. molecular transducer activity; 53. nucleic acid binding transcription factor activity; 54. structural molecule activity; 55. transcription factor activity, protein binding; 56. transporter activity.

图2 差异表达基因GO功能分类

2.5 转录组的实时荧光定量PCR验证

为了验证转录组测序结果的可靠性,从转录组数据中筛选出影响褐变的关键基因7个,以ACTIN基因为内参基因,对这些差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证，结果见表1。对获得的qRT-PCR数据和转录组测序数据做相关性分析,结果发现7个差异基因的表达趋势与转录组分析结果的表达趋势基本相同,证明了转录组测序获得的基因表达信息是可靠的(图4)。

图4 不同阶段差异基因的荧光定量PCR检测结果

3 讨论

基于转录组高通量测序技术,本研究对褐变前、后的玉木耳子实体进行了转录组测序,共获得数据30.26 G。对筛选获得的差异表达基因进行统计分析,结果表明共存在5915个差异基因,其中有924个Unigene上调表达,有4991个Unigene下调表达。这些差异表达的基因可能直接或间接影响玉木耳子实体的褐变。例如,在络氨酸代谢途径(ko00350)中酪氨酸酶基因推测与玉木耳褐变有关。酪氨酸酶[TYR, tyrosinase (EC:1.14.18.1)]是一种双核含铜酶,一般也称为多酚氧化酶,在生物体合成黑色素过程中起关键作用[6]。酪氨酸酶主要在L-dopa途径中发挥作用,其催化单酚化合物酪氨酸羟化形成二元酚即3,4-二羟基苯丙氨酸,之后进一步被氧化形成多巴醌,多巴醌再经一系列反应后,最终生成黑色素[7]。1974年,Turner等提出了酪氨酸酶基因在双孢蘑菇黑色素的合成中可能发挥相当重要的作用[8]。彭博等通过对不同贮藏时期的双孢蘑菇进行转录组测序,筛选出PPO1、PPO3、PPO5等5个可能与双孢蘑菇子实体褐变相关的多酚氧化酶基因[9]。杨亦农等利用基因编辑技术对双孢蘑菇中的多酚氧化酶基因进行编辑,使该酶的活性降低了30%,使双孢蘑菇更抗褐变[10]。此外,褐变子实体中漆酶基因(Cluster- 50942.6597)的表达量显著上调。漆酶(Lac, Laccase, EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,归类于蓝色多铜氧化酶家族(MCO),能够催化氧气还原成水,并将酚类物质或者多酚类物质转化成对应的醌[11]。漆酶基因在香菇中被研究最多,目前在NCBI数据库中已有10个香菇漆酶基因序列。研究表明,在香菇子实体衰老的后期,漆酶基因lcc2、lcc4的表达量较高,并伴随着香菇细胞壁的溶解以及菌褶的转色,推测这些基因在香菇黑色素形成过程中发挥了一定的作用[12-16]。以上这些研究结果为后期进一步分析差异基因与玉木耳组织褐变的调控关系提供了初步的理论参考和依据。