过敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3表达及与Th17/Treg失衡的关系

钟洁，陶宁，赵利，何诚，胡建平

过敏性哮喘是一种慢性炎性气道疾病，由多种炎性细胞介导发生，全世界大约有3.5亿过敏性哮喘患者，每年增加速率大约为3%，发病率逐年上升[1]。过敏性哮喘发病机制尚不明确，近年研究发现[2]，辅助性Th17细胞及调节性T细胞(Treg)在哮喘发病中占有重要地位。细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)家族是一类反馈性阻断细胞因子信号转导过程的调节因子，由细胞因子诱导产生，SOCS-1、SOCS-3是SOCS家族中重要的2种分子[3-4]。T细胞亚群在免疫应答和调节中发挥重要作用。研究发现[5-6]，SOCS-1、SOCS-3可通过调节T细胞亚群分化影响不同类型的免疫应答。研究表明[7]，SOCS-1、SOCS-3可被多种炎性因子和抗炎因子诱导表达，在免疫应答和免疫调节中起到重要作用。研究显示，Th17参与多种炎性疾病及自身免疫性疾病的发生发展，如系统性红斑狼疮、自身免疫性关节炎等[8]。体内炎性因子的异常波动可能会引起Th17/Treg比例失衡，临床上对于Th17/Treg失衡在过敏性哮喘发生发展中的意义鲜有研究报道。现检测过敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平，并分析其与Th17/Treg失衡的关系及意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年4月—2019年9月四川省遂宁市中心医院急诊科诊治过敏性哮喘患者60例为哮喘组，男 31例，女29例，年龄22～54(38.15±8.23)岁；病程1～10(2.05±1.02)年；哮喘程度，轻度32例，中重度28例；患者无家族遗传史，无其他慢性病史。选取同期医院进行体检的健康体检者60例作为健康对照组，男30例，女30例，年龄24～56(39.01±8.57)岁，均经皮肤过敏原点刺试验为阴性，且无过敏性疾病及其他慢性疾病史，无长期用药史，近1周内无急性感染情况。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①符合过敏性哮喘诊断标准者，哮喘诊断标准参照全球哮喘防治创议(global initiative for asthma，GINA)和中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的“支气管哮喘防治指南(2016年版)”[9]；②皮肤点刺试验结果粉尘螨、户尘螨阳性者，血清特异性IgE检测结果为阳性(血清总IgE>200 U/ml)；③无其他心血管系统疾病、自身免疫系统疾病等基础疾病；④取血4周内未使用过糖皮质激素、肝素、免疫抑制剂或其他影响试验结果的药物；⑤1周内无急性感染，无过敏性疾病、其他慢性病史。(2)排除标准：①非过敏性哮喘患者；②皮肤过敏原点刺试验或血清过敏原特异性抗体均为阴性者；③患有免疫系统疾病者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 样品制备：无菌条件下抽取2组受试者空腹状态下外周静脉血5 ml， 其中3 ml加入无菌肝素(20 IU/ml)抗凝管，使用密度梯度离心法对外周血单个核细胞进行分离；2 ml直接离心取血清，用于 ELISA检测。

1.3.2 Th17细胞、Treg细胞百分率检测：在测试管、对照管中加入外周血单个核细胞，RPMI-1640稀释后，加入PMA和BFA二氧化碳培养箱中孵育，使用抗人CD4-FITC、IL-17A PE孵育检测Th17细胞百分率的样品， CD25-PE孵育检测Treg细胞百分率的样品；对照管使用MouseIgG1-PE孵育进行对照。使用PBS缓冲液反复洗涤后放入流式细胞仪进行检测[Attune NxT款流式细胞仪，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，CD4+T细胞设门，分析门中CD4+IL-17+T细胞(Th17细胞)百分率、CD4+CD25+阳性T细胞百分率。

1.3.3 SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平检测： 采用RNA提取试剂盒(购自北京天根生化有限公司)提取血清总RNA，反转录得cDNA。采用定量PCR仪(CFX96型qRT-PCR仪，购自美国Bio-Rad公司)对SOCS-1、SOCS-3 mRNA进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μl，miScript SYBR®Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反应条件：95℃ 90 s，95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，45个循环，AceQ qPCR SYBR®Green Mix试剂盒购自南京vazyme生物公司。SOCS-1、SOCS-3 mRNA及内参GAPDH的引物序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。采用2-△△CT法对血清SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 血清炎性因子水平检测： 采用酶联免疫法测定(ELX800型全自动酶标仪，购自美国Bio-Tek公司)血清白介素-6(IL-6)、IL-17、IL-23、人转化生长因子β1(TGF-β1)、干扰素(IFN-γ)水平，检测操作严格按照试剂盒说明书进行。IL-6 ELISA试剂盒购自Sinobiological公司；IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；IFN-γ试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；为控制检测质量，本次研究所有样品的检测均由检验科同一批人员在同台仪器上操作，每个样本均设3次重复。

1.3.5 肺功能检测: 选择肺功能检测仪对所有受试者进行肺功能检测，检测指标包括最大呼吸第1 s呼出气量(FEV1)、用力肺活量(FVC)、第1 s用力呼吸容积比值(FEV1%)FEV1/FVC。

2 结 果

2.1 2组外周血Th17细胞、Treg细胞百分率及Th17/Treg比值比较 哮喘组外周血Th17细胞百分率、Th17/Treg比值显著高于健康对照组(P<0.01)，Treg细胞百分率显著低于健康对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组外周血Th17细胞、Treg细胞百分率及Th17/Treg比较

2.2 2组外周血单个核细胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平比较 哮喘组外周血单个核细胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平高于健康对照组 (P<0.01)，见表3。

表3 2组外周血单个核细胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平比较

2.3 2组血清炎性因子水平比较 与健康对照组比较，哮喘组血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表达水平显著升高(P<0.01)，IFN-γ表达水平显著降低(P<0.01)，见表4。

表4 2组炎性因子水平比较

2.4 2组肺功能比较 哮喘组患者FEV1、FVC、FEV1%均显著低于健康对照组(P<0.01)，见表5。

表5 2组肺功能比较

2.5 SOCS-1、SOCS-3 mRNA与Th17/Treg、炎性因子水平相关性分析 过敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA与Th17/Treg比值呈正相关(r=0.488、0.606，P<0.05)，见图1、图2； SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平均与IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1水平呈正相关(P<0.01)，与IFN-γ水平呈负相关(P<0.01)；SOCS-3 mRNA水平与SOCS-1 mRNA水平呈正相关(r=0.471，P<0.01)，见表6。

图1 SOCS-1 mRNA与Th17/Treg比值相关性分析

图2 SOCS-3 mRNA与Th17/Treg比值相关性分析

表6 SOCS-1、SOCS-3 mRNA与炎性细胞因子水平相关性分析

3 讨 论

本研究发现，过敏性哮喘患者外周血单个核细胞中SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平相对于健康对照组显著上调，提示SOCS-1、SOCS-3可能与过敏性哮喘发病有关，其中SOCS蛋白是天然免疫和获得性免疫系统中关键的生理性调节因子，参与调节T细胞的发育和分化、抑制细胞因子信号通路等，在免疫性疾病、感染性疾病发生中发挥重要作用[10-13]。有学者研究认为[14]，SOCS-1通过SH2结构域与细胞因子受体胞内段Janus激酶(JAK)结合，使之泛素化后降解，从而阻滞INF-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12等多种细胞因子的信号经STAT途径传导。SOCS-1缺陷小鼠表现出T细胞大量激活的剧烈炎性反应[15]。因此，SOCS-1被认为是防止自身免疫的重要调节分子。夏家露等[16]研究发现，SOCS-3 mRNA表达水平下调的小鼠体内IL-4水平减少，提示IL-4水平受SOCS-3 mRNA表达水平调节，二者与过敏性哮喘发生有关。说明SOCS-1、SOCS-3可能与过敏性哮喘的发病有关，推测其主要是通过调节T细胞的分化及抑制细胞因子信号通路而发挥作用。

长期以来的观点认为，Th1/Th2失衡在过敏性哮喘中有重要作用，近年来发现Th17/Treg失衡在过敏性哮喘中作用同样突出[17]。Treg不同于Th1/Th2，它可以表现出免疫抑制功能。初始CD4+T细胞在IL-12和IFN-γ诱导下分化为Th1细胞，参与细胞介导免疫应答；在TGF-β单独诱导下分化为Treg细胞，分泌TGF-β，参与免疫调节；在TGF-β和IL-6的共同诱导下分化为Th17，分泌IL-6和IL-17，参与炎性反应和自身免疫性疾病[18]，IL-6可促进活化的CD4+细胞向Th17分化，形成正反馈。本研究发现，哮喘组血清中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表达水平显著升高，IFN-γ表达水平显著降低，哮喘组Th17细胞百分率、Th17/Treg比值显著高于健康对照组，Treg细胞百分率显著低于健康对照组，提示Th17、Treg细胞百分率的变化和比例与过敏性哮喘有关。而有关研究发现[19-20]，IL-6能促进急性期蛋白合成，介导前列腺素合成，从而参与哮喘的炎性反应。IL-17是一种促炎性细胞因子，可作用于气道上皮细胞等炎性细胞，通过刺激趋化因子、细胞炎性因子等促进嗜中性粒细胞、巨噬细胞募集引发炎性反应[21]。李小明[22]研究发现，哮喘患者支气管活检标本IL-17水平较健康者高，且与疾病严重程度有关，提示IL-17参与哮喘的发生发展。洪菲萍等[23]研究发现，经过治疗后支气管哮喘急性发作患儿病情显著好转，血清中IFN-γ水平显著升高，IFN-γ有助于支气管哮喘的诊断及病情变化的判断。Yan等[24]研究发现，过敏性哮喘患者外周血IL-17水平较健康对照组表达增加，说明IL-17可能在哮喘初期或疾病进展期间发挥作用，但其作用尚未确定。Guerra等[25]研究发现，IL-23在过敏性哮喘等免疫类疾病中发挥重要作用。Chu等[26]研究发现，TGF-β1在哮喘组血清中水平高于健康对照组，可能与难治性哮喘发生有关。本研究与以往研究结果相似，提示过敏性哮喘患者存在不同程度炎性反应，可能与Th17/Treg失衡有关。

进一步研究发现，过敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表达水平与IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1呈正相关，与IFN-γ水平呈负相关；SOCS-1、SOCS-3 mRNA与Th17/Treg比值呈正相关，提示SOCS-1、SOCS-3 mRNA可能通过对细胞因子的调控影响Th17、Treg的细胞数量从而影响Th17/Treg比值。

综上所述，过敏性哮喘患者外周血中存在SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表达，以Th17细胞比率上升为主的Th17/Treg失衡，且过敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表达与Th17/Treg失衡有关。但本研究样本量不充分，需要扩大样本量对SOCS-1、 SOCS-3 mRNA在过敏性哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用机制进行深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

钟洁：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；陶宁：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；赵利：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；何诚：进行统计学分析；胡建平：课题设计，论文撰写