磁共振波谱技术测定中国人群血脂亚组分的初步探讨

蔺亚晖，杨琼，苏保满，康金锁，周洲

动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）仍是威胁中国居民生命的“头号杀手”，且近年来我国ASCVD 患病人数始终处于上升趋势[1]。血脂异常是ASCVD 的九大危险因素之一，2016 年《中国成人血脂异常防治指南》推荐甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测为血脂基本筛查指标[2]，并将LDL-C 作为ASCVD 和糖尿病预警、用药指导和降脂监测工作中最为核心的检测指标。然而，研究发现LDL-C 水平仅能解释50%的ASCVD[3]，脂蛋白电泳发现，血脂中低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等常规血脂指标仍能细分为多种亚组分。另一方面，脂蛋白颗粒的数量与粒径与ASCVD具有显著相关性，粒径越小、颗粒数越多具有极度的致动脉粥样硬化作用。相同LDL-C 浓度下，其包含的血脂亚组分具有差异。因此，进一步研究血脂亚组分的特征将有助于评估ASCVD 风险，并有可能成为干预的靶标。

磁共振波谱技术（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMRS）是光谱学的一个分支，在强磁场中带核磁性的分子或原子核吸收电磁辐射从低能态向高能态跃迁过程中产生共振谱，经计算机数学模型的数字转换，用于测定混合物中成分的数目、类型和相对位置。1990 年，NMRS 首次被用于血脂成分的检测，随后被标准化并用于临床血脂亚组分谱的检测。其原理主要是通过NMRS 检测磷脂、未酯化胆固醇、胆固醇酯和TG 末端甲基集团的质子数量。血脂颗粒内核中酯化胆固醇和TG 各含三个末端甲基，表面的磷脂和未酯化胆固醇各含有两个末端甲基集团。NMRS 通过检测四类末端甲基质子数量，确定脂蛋白亚组分的质量、颗粒数和粒径等特征，可对LDL 平均粒径、以及极低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）亚型及各亚型中脂类分布进行定量检测[4]，美国糖尿病管理指南推荐NMRS 作为血脂亚组分检测的三种方法之一[5]。但是，在中国临床应用中尚未见相关正常参考范围的报道。

本研究首先对该项技术的性能进行验证，随后建立基于NMRS 的中国健康人群血脂亚类指标的正常参考范围，为NMRS 血脂检测在国人健康预警、精细选药及ASCVD 疗效监测等临床应用打下基础。

1 资料与方法

1.1 研究人群

本研究已通过阜外医院伦理委员会审批（审批号：2017-877），共包含1 091 例研究对象，其中包含2018 年10 月到2019 年4 月间纳入的691 例主诉无动脉硬化性心血管疾病的健康体检人群以及400例随机抽取的阜外医院住院患者。691 例健康人群的纳入标准为：≥18 岁；血压正常[未经服药情况下收缩压＜140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；舒张压＜90 mmHg]；肝肾功能正常；空腹血糖＜6.1 mmol/L（未经服药）；常规血脂指标中TC、TG 不高于正常参考上限；HDL-C 不低于正常参考下限；LDL-C ≤3.4 mmol/L（未经服药）。排除标准为：有心脑血管疾病史；孕妇；服用任何调整血脂、血压、血糖药物的个体；4 周内发生重大疾病或入院者。691 例健康人群按照性别分组，用于建立男性和女性的NMRS 各项血脂指标的正常参考范围，400 例心血管疾病患者用于比较不同血脂分布下NMRS 与常规生化检测方法的相关性和性能学验证。

1.2 样本处理

常规生化检测：研究对象空腹8 h，采集血液于含惰性分离胶的血清管中，放置至血液充分凝固后3 000 rpm 离心10 min，取上清检测。所用仪器为美国贝克曼AU5811 全自动生化分析仪，血脂项目检测原理：TC、TG、LDL-C、HDL-C 为酶比色法，载脂蛋白A1（Apo-A1）和载脂蛋白B（Apo-B）为免疫比浊法。

NMRS 检测：采集研究对象全血2 ml（空腹8 h、含EDTA-K2抗凝剂的BD 采血管），1 500 g 离心10 min，转移上层血浆到冻存管中，储存于-80 ℃冰箱中待测。检测时，将样本从冰箱中取出，等待完全解冻后，取400 μl 血浆与NMRS 血脂缓冲液（美国布鲁克Bruker Biospin）1 :1 混合，充分混匀后置于5 mm 核磁管中，载入自动进样器中等待检测。

1.3 NMRS 血脂检测及检测项目

依据AVANCE IVDr 磁共振波谱仪系统（美国布鲁克Bruker Biospin）的标准操作规程进行检测[6]，并采用配套软件Topspin 对原始数据解析，使用TSP（trimethylsilylpropanoic acid）及1.48 ppm 处的丙氨酸双峰信号对化学位移进行校正；使用0.8 ppm 及1.25 ppm 处的脂蛋白链-CH3及-CH2-信号群的积分对脂蛋白各亚类进行定量。最终NMRS 血脂检测将VLDL 分为5 个亚组分（VLDL-1～5），LDL 分为6个亚组分（LDL-1～6），HDL 分为4 个亚组分（HDL-1～4），以及粒径及颗粒数量。

1.4 NMRS 血脂检测平台稳定性评估

图1 20 次等份样本一氢磁共振波谱图中脂蛋白亚类信号区域

根据美国临床实验室标准化学会的指南（Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI）规定，对NMRS 血脂检测平台的方法学稳定性进行评估。取20 例患者的EDTA 血浆各0.5 ml 进行混合，混合均匀后等量分装为20 管，储存于-80℃冰箱中，每次取出一管、每日2 次（每次间隔8 h）、连续10 天对等分样本重复进行前处理及NMRS 扫描检测。

1.5 统计学方法

所有数据采用MedCalc 15.2.2 软件统计分析。NMRS 血脂定量检测的稳定性通过计算相关检测指标的20 个重复检测值的变异系数（CV，%）进行评价。使用一元线性回归分析NMRS 血脂检测结果与临床检测值的相关性，通过决定系数（R2）对结果进行判定。取不同组别健康人群的NMRS 血脂检测结果进行统计，取所有检测值的95%CI 统计不同性别血脂指标正常参考范围，并使用曼-惠特尼U检验对不同组别进行差异统计。P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NMRS 血脂检测平台稳定性评估

本研究通过TG、TC、LDL-C、HDL-C、Apo-A1、Apo-B 6 项血脂指标的重复检测证实NMRS 谱图在20 次检测中的重复性好（图1A、1B），6 项血脂指标的批间变异系数在1.39%～2.62%之间（表1）。

表1 6 项常规血脂指标平均值及变异系数

2.2 NMRS 血脂检测与临床常规生化方法学检测结果之间相关性

对NMRS 方法与常规生化方法所共有的6 项临床血脂检测指标（TG、TC、LDL-C、HDL-C、Apo-A1、Apo-B）的结果进行相关性研究，两种方法学的检测结果进行一元线性回归，得到的相关性曲线（图2A～F ）。在400 例患者的NMRS 检测结果中，统计了6 项临床血脂检测指标的最大值、最小值以及各指标90%人群落在的区间范围（表2），两种方法学所检测的数据之间的相关系数（R2）在0.927～0.978 之间。

2.3 中国人群NMRS 血脂亚组分检测正常参考范围（表3、表4、图3）

图2 400 例样本中磁共振波谱技术与常规生化方法学6 项共有临床血脂检测指标的相关性曲线

表2 400 例患者的磁共振波谱技术检测结果中6 项指标的最大值、最小值以及各指标90%人群落在的区间范围相关性

表3 691 例健康人群基线资料（±s）

表3 691 例健康人群基线资料（±s）

表4 不同血脂亚类的参考范围

依据纳入、排除标准入选的691 例健康人群基线资料（表3）。NMRS 检测的常规血脂指标（TC、TG、Apo-A1、Apo-A2、Apo-B100、LDL-C、HDL-C）、LDL 颗粒平均粒径、VLDL、LDL、HDL 组分的颗粒数以及5 个VLDL 亚组分（VLDL-1～5）、6个LDL 亚组分（LDL-1～6）、4 个HDL 亚组分（HDL-1～4）的TC 和TG 浓度的总体正常参考范围详见表4。

LDL平均粒径、VLDL、IDL、LDL 总体及LDL 各亚组分颗粒浓度在健康人群中的分布情况详见图3。

图3 LDL 平均粒径及亚组分颗粒浓度在健康人群中的分布情况

性别亚组分分析显示，男性和女性LDL 颗粒平均粒径呈偏态分布，其中位数分别为20.3 nm 和20.5 nm，差异具有统计学意义（P＜0.001）。男性VLDL和IDL 颗粒浓度显著多于女性（中位数：148 nmol/L vs 106 nmol/L；51 nmol/L vs 42 nmol/L；P＜0.001）；不同性别的LDL 颗粒浓度无显著差异，但是LDL 亚组分中，LDL-1、LDL-2 和LDL-3 在男性中显著低于女性，中位数分别为178 nmol/L vs 199 nmol/L、148 nmol/L vs 169 nmol/L、180 nmol/L vs 197 nmol/L（P均 ＜0.001）；LDL-4 颗粒浓度在不同性别中无显著差异（中位数：196 nmol/L vs 190 nmol/L；P＞0.001）；与之相反，女性LDL-5 和LDL-6 颗粒浓度中位数分别为155 nmol/L、240 nmol/L，显著低于男性（中位数：206 nmol/L、316 nmol/L）。

VLDL 亚组分中，男性VLDL-1～4 中TG 含量显著高于女性，中位数分别为29.9 mg/dl vs 14.5 mg/dl、13.1 mg/dl vs 8.15 mg/dl、11.9 mg/dl vs 9.17 mg/dl、7.6 mg/dl vs 7.1 mg/dl；相反，男性VLDL-5 中TG 含量显著低于女性，中位数为2.0 mg/dl vs 2.2 mg/dl。男性VLDL 各亚组分TC 含量中除VLDL-5 外，VLDL-1～4 TC 含量均显著高于女性，中位数分别为5.2 mg/dl vs 2.6 mg/dl、2.9 mg/dl vs 1.7 mg/dl、3.9 mg/dl vs 2.6 mg/dl、3.4 mg/dl vs 2.7 mg/dl。

LDL 亚组分中，男性LDL-1～3 中TC 含量显著低于女性，中位数分别为19.5 mg/dl vs 21.1 mg/dl、14.8 mg/dl vs 16.9 mg/dl、16.9 mg/dl vs 19.5 mg/dl（P＜0.001）；LDL-5 和LDL-6 中TC 含量（中位数：16.2 mg/dl vs 12.9 mg/dl 和 21.3 mg/dl vs 17.2 mg/dl）为男性高于女性；而LDL-4 TC 含量在男性和女性中相似（中位数：18.0 mg/dl vs 18.5 mg/dl）。LDL-1～6 中TG含量与之相似，中位数分别3.8 mg/dl vs 4.0 mg/dl、1.8 mg/dl vs 2.1 mg/dl、1.3 mg/dl vs 1.5 mg/dl、1.8 mg/dl vs 1.9 mg/dl、2.0 mg/dl vs 1.6 mg/dl、3.1 mg/dl vs 2.6 mg/dl。

HDL 亚组分中，男性HDL-1～3 中TC 含量显著低于女性，中位数分别为12.7 mg/dl vs 17.0 mg/dl、6.6 mg/dl vs 9.0 mg/dl、8.8 mg/dl vs 10.5 mg/dl（P＜0.001）；而HDL-4 中TC 含量中男性高于女性（中位 数：21.3 mg/dl vs 20.4 mg/dl；P＜0.001）。HDL 亚 组分中仅有HDL-1、HDL-4 中TG 含量在不同性别间差异具有统计学意义，其中HDL-1 中TG 含量男性低于女性（中位数：2.6 mg/dl vs 3.1 mg/dl；P=0.008），HDL-4 中TG 含量男性高于女性（中位数：3.4 mg/dl vs 2.9 mg/dl；P＜0.001）。

3 讨论

本研究首先通过对TG、TC、LDL-C、HDL-C、Apo-A1、Apo-B 6 项常规血脂指标的重复性检测，显示NMRS 方法具有很好的重复性，随后与临床常规生化方法学检测之间相关性研究显示NMRS 方法检测结果与现有实验室常规检测方法具有很好的一致性，最后建立了中国人群LDL 颗粒平均粒径、VLDL、LDL、HDL 组分的颗粒数以及5 个VLDL 亚组分、6 个LDL 亚组分、4 个HDL 亚组分的TC 和TG 浓度的正常参考范围，性别亚组分分析显示，大部分在男性和女性间具有差异，最好采用性别特异性参考范围。

LDL-C 虽然作为各血脂指南管理的核心指标，但是仍不能代表所有人群的ASCVD 风险[7]。一项针对约13 万例冠心病住院患者血脂水平的分析显示，近半数的住院冠心病患者LDL-C 水平正常[3]；另一基于6 814 例ASCVD 患者检测数据研究显示，LDL-C与LDL 颗粒浓度在同一患者中并不协同变化，LDL颗粒较LDL-C 更能反映心血管疾病（CVD）风险[8]。在针对2 072 例CVD 患者脂蛋白亚组分的分析研究中，提示LDL-C 达标的ASCVD 患者是由于致病亚组分升高，揭示亚组分分析能提供进一步的预警；2012 年，美国临床内分泌医师协会将脂蛋白亚组分检测写入《血脂异常和动脉粥样硬化预防管理指南》，提出临床医生对于血脂参数虽然达标但动脉粥样硬化仍继续恶化的患者，应进一步进行脂蛋白亚组分分析；并在2017 年将LDL 颗粒浓度列为附加风险因素[9]。越来越多的证据表明检测血脂颗粒的重要性，而NMRS 血脂检测是满足LDL 颗粒和亚组分血脂检测的重要方法之一。

大数据研究表明，使用贝特类（吉非贝齐、非诺贝特）、吡格列酮、前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抑制剂类药物或与他汀类联合用药以降低ASCVD 事件发生率[10-12]。将NMRS 提供的LDL 颗粒监测指标应用于临床，能出具以检验学为基础的选药依据。因而，NMRS 血脂检测不但能进一步评估ASCVD 风险，还有利于实现临床调脂治疗的个体化合理用药[13]。

根据LDL 平均粒径的大小可以对LDL 进行区分，粒径较大、密度较低（粒径20.6～22.0 nm）的LDL颗粒被定义为A 型（Pattern A），颗粒较小、密度较大（粒径19.0～20.5 nm）的为B 型（Pattern B）[14-15]，而以B 型LDL 为主的人群中ASCVD 事件出现频率较A 型人群高出3 倍以上，因而评估LDL 平均粒径对ASCVD 风险评估具有重要临床意义[16]。LDL 平均粒径在不同性别的健康人群中均随着年龄的增大而减小，且在不同年龄段的女性中呈现显著性差异，预示着更高的CVD 风险。

本研究仍存在一些局限性。首先，本研究入选的队列虽然排除了服用调整血脂、血糖药物的个体，但是未记录一些与代谢相关的药物使用情况，例如已知甲状腺功能减退患者的TC 和LDL-C 水平显著升高，同时大尺寸LDL 和HDL、小尺寸VLDL 浓度水平均增加[17]。另一方面，雌激素水平与雌激素替代治疗法可增加HDL-C 和Apo-A1 水平而降低LDL-C 和TG 水平[18]。在多囊卵巢综合征患者中，也发现虽然LDL-C水平无显著变化，但是小尺寸LDL显著升高[19]。其次，本研究选择的健康人群，虽然已经考虑了常规血脂、血糖、肝肾功、心脑血管病史等常规因素，但是尚缺乏心脏或颈动脉超声、影像学证据等，以进一步排除表观隐匿性动脉粥样硬化性疾病。因此，本研究所获数据仅可作为中国表观健康人群血脂亚组分的参考数据。目前，本课题组已经启动增加影像学证据和确切药物服用史的健康人群筛选研究，以最终建立血脂亚组分的确切参考区间。

近年来，血脂检测越来越多的将研究目标指向血脂指标的亚组分，而NMRS 血脂检测在提供目前临床指标的同时，出具大量亚组分数据是血脂临床研究的利器[20]。本研究建立了中国人群不同性别的NMRS 血脂检测正常值范围，能够为高血压、糖尿病、肥胖和吸烟等具有ASCVD 危险因素的人群提供更敏锐的血脂预警，NMRS 血脂检测的特色指标也能够对已患有ASCVD 的患者提供有效的用药指导与全面的疗效监测，为NMRS 血脂检测在ASCVD 预警、疾病管理领域的临床应用做了基础准备。