四川省新型冠状病毒相关实验室检测及生物安全操作专家共识

蒋 黎，刘靳波，郭晓兰，熊大迁，许 颖，应斌武，肖代雯，黄文芳，杨正林

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.西南医科大学附属医院检验科，四川 泸州 646000；3.川北医学院附属医院检验科，四川 南充 63700；4.成都中医药大学附属医院检验科，四川 成都 610075；5.成都医学院第一附属医院检验科，四川 成都 610500；6.四川大学华西医院实验医学科，四川 成都 610041)

为加强四川省新型冠状病毒感染的防控工作，指导省内相关医疗机构实验室开展新型冠状病毒相关检验，同时保障实验室生物安全，依据国家卫生健康委办公厅印发的《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第三版)》、《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第三版)》、《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》、《关于新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》和中华医学会检验分会发布的《2019新型冠状病毒相关实验室检验及生物安全防护指南(试行第一版)》等文件，制订本共识。

1 适用范围

本指南适用于四川省医疗机构医学实验室开展新型冠状病毒肺炎及疑似病例的实验室检验，包括新型冠状病毒核酸检测、IgM/IgG抗体血清学检测，及辅助诊断和/或病情监测所需血常规、尿常规、C反应蛋白、降钙素原、生化指标(肝酶、心肌红酶、肾功等)、凝血功能等项目的检测。

2 新型冠状病毒肺炎的病原学及流行病学特点

2019年12月底，在湖北武汉爆发了由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，并迅速蔓延到全国其他省市，以及境外多个国家和地区[1]。截至2020年3月，全球37个国家和地区累计报告新型冠状病毒肺炎病例已超过八万，死亡病例近3000，其中大约96%的病例发生在中国[2，3]。SARS-CoV-2是从人类分离的第7类冠状病毒，具有冠状病毒家族的典型特征，属于β-冠状病毒。对新型冠状病毒的全基因组测序和分析显示，该病毒明显区别于SARS-CoV和MERS-CoV，而与蝙蝠SARS样冠状病毒 RaTG13 株全基因组亲缘关系最近，同源性为 96%。冠状病毒对紫外线和热敏感，56 ℃ 30 min，乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效消灭病毒。氯己定不能有效灭活病毒。

新型冠状病毒肺炎的潜伏期平均5～6天，范围为1～14天。目前明确的传染途径包括呼吸道飞沫和密切接触，相对封闭环境中长时间暴露于高浓度气溶胶。人群普遍缺乏免疫力，几乎人人易感。主要体征和症状包括发热、干咳、乏力、咳痰、气短、肌痛或关节痛、咽痛和头痛。多数感染者为轻症并可痊愈，但年龄60以上及有基础疾病的感染者可发展为重症肺炎及死亡。

新型冠状病毒肺炎的实验室表现包括，发病早期外周血白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少，部分患者出现肝酶、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酶和肌红蛋白增高；部分危重者可见肌钙蛋白增高。多数患者C反应蛋白(CRP)和血沉升高，降钙素原正常。严重者D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少。重型、危重型患者常有炎症因子升高[5]。患者鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸。为提高核酸阳性检出率，建议采集下呼吸道样本送检。研究表明，肺和肠道组织能够分离出新型冠状病毒，具有传染性[5]。患者血液和其他体液尚不能确定是否含有活病毒，但所有样本均应按有传染性处理。新型冠状病毒肺炎发病早期特异性IgM抗体升高，及疾病中期到恢复期特异性IgG抗体的逐步升高。

3 实验室安全原则

①新型冠状病毒暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理。②病毒分离培养、动物实验要求生物安全三级实验室，并须经省级卫生健康行政部门审核后报国家卫生健康委批准方可开展。③未经培养的感染性材料，如不能可靠灭活，进行临床检验时，应在生物安全二级实验室，采用生物安全三级实验室的个人防护。

4 生物安全防护

4.1 防护用品医用外科口罩(YY0469-2011)、医用防护口罩(GB19083-2010)、N95(美国NIOSH42CF R84-1995，中国KN95[GB2626-2019])、全面型呼吸防护器、防护服、隔离衣、工作服、乳胶手套、医用防护帽、护目镜、面屏、靴套。防护用品由专人领取、发放。

4.2 生物安全防护级别①一级生物安全防护：医用外科口罩、乳胶手套、工作服、医用防护帽，加手卫生。②二级生物安全防护：医用防护口罩、乳胶手套、工作服外隔离衣、医用防护帽，加手卫生。酌情可加护目镜。③三级生物安全防护：医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、工作服外防护服、医用防护帽，靴套，加手卫生。

4.3 紫外线须定期检测性能、完整记录、累积不超过规定时限。每次消毒时间不少于30 min。

4.4 消毒液每天试验前后使用 500 mg/L 有效氯的消毒液(84消毒液100倍稀释)或75%乙醇进行桌面、台面及地面消毒。

4.5 手卫生掌握正确地洗手方法(六步洗手法)和时机。不随意触摸面部皮肤、摸眼睛、挖鼻孔等。建议剪短长发，禁止饰物。

4.6 高压灭菌废弃物打包后，就地进行121 ℃ 15 min高压灭菌，每次用化学指示胶带和化学指示卡进行监测，每月用生物指示剂监测灭菌效果。

5 标本采集

5.1 采集对象新型冠状病毒肺炎疑似/确诊病例、近期有新型冠状病毒肺炎患者暴露史人员，上呼吸道疾病患者及非典型性肺炎患者等的新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者。

5.2 采集项目①筛查和疑似病例建议申请必须的检测项目包括血常规、全血CRP、新型冠状病毒血清学及核酸检测。②确诊病例进行诊疗必要的检测项目，为避免实验室人员风险，尽可能少开展手工检测项目。

5.3 采集防护①呼吸道飞沫、气溶胶，对采集者有传播威胁，接触其皮肤、衣物和日常用品，有接触传播的风险，因此，采集者需三级生物安全防护(医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、防护服、医用防护帽，靴套)。②患者要求佩戴外科口罩或其他呼吸屏障，避开患者咳嗽和呼吸道诊疗操作。③采集过程须兼顾安全和目标，在能够达成目标的情况下，尽量减少接触、尽量避免气溶胶和飞沫产生、尽量缩短在床旁的持续时间。④患者自主完成采集时，如咳痰、粪便标本，医师或护士交代完医嘱后即行回避。

5.4 常见采集方法①新型冠状病毒核酸检测的标本类型包括上呼吸道的咽拭子、鼻拭子和鼻咽抽取物，下呼吸道的深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液和肺组织活检标本。为提高呼吸道样本的新型冠状病毒核酸阳性检出率，兼顾采样的便捷性，首选深咳痰，其次鼻咽拭子，最后才是咽拭子。可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。a.咽拭子：用1～2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3 ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。b.鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3 ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。c.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取黏液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的黏液，并用3 ml采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50 ml注射器上来替代收集器)。d.深咳痰液：用清水(勿用含消毒剂的漱口液)漱口2～3次，有假牙者取出假牙后漱口，要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3 ml采样液(细胞保存液)的50 ml 螺口痰杯中。e.支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管(约30 cm深处)，注入5 ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的黏液，并用采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50 ml注射器上来替代收集)。f.肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50 ml，总量100～250 ml，不应超过300 ml。②血液标本：按项目要求选择正确的真空采集管采集血液标本4 ml进行检测。③大小便样本：依据需求规范采集，旋紧管盖。送检标本容器外必须贴含样本编号、种类、患者姓名及采样日期等信息的识别条码。

6 标本转运

6.1 标本转运箱①要求准备正规、密封良好、有生物危害标示及新型冠状病毒标本标识的专用转运箱。②转运箱一般不进入隔离病房；如果是从隔离病房内取出，需要外部清洁消毒。

6.2 标本转运人员转运人员需二级生物安全防护(医用防护口罩、乳胶手套、工作服外隔离衣、医用防护帽)。

6.3 标本转运流程①标本采集者或辅助者将样本放入双层密封标本袋内后，置于新型冠状病毒专用转运箱，75%酒精消毒后封闭，并由专人单独转运到实验室。②转运期间不能自行打开转运箱，并保持转运箱平稳，避免剧烈震荡、颠簸。③转运期间如果发生意外，转运者不要自行处理转运箱，须到接收地点说明情况，共同处理。

7 标本接收

7.1 实验室接收人员接收人员须二级生物安全防护(医用防护口罩、乳胶手套、工作服外隔离衣、医用防护帽)；特殊情况时，升级为三级生物安全防护(医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、防护服、医用防护帽，靴套)。

7.2 接收流程①接收者在生物安全柜内打开转运箱，从密封袋取出标本，容器表面喷洒75%乙醇消毒。②通过LIS系统或手工登记完成每个样本的签收。③接收时确认新型冠状病毒标本转运箱标识，如果没有标识，拒收标本。④确认样本在装箱前有消毒环节，并在开箱瞬间用75%乙醇喷洒消毒。

8 标本前处理

8.1 实验室前处理人员前处理人员需三级生物安全防护(医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、防护服、医用防护帽，靴套)。

8.2 前处理流程①血常规、凝血等闭管操作项目标本无需处理，直接上机检测。②其他生化、免疫等项目需离心处理的血液标本，则尽可能在生物安全柜中放入和取出离心机转子；离心时，操作者不能离开离心机，离心停止15 min以上取出，并在生物安全柜中消毒、开盖；如果离心过程有异常声响，则停止离心30 min以上后开盖，并消毒。③新型冠状病毒核酸检测的呼吸道样本作56 ℃30 min干浴灭活处理，待采样管降至常温后，才能在生物安全柜内开盖。

9 实验室检验

9.1 基本原则①所有新型冠状病毒相关检测必须在空间相对独立的生物安全二级实验室开展，操作人员需三级生物安全实验室个人防护(医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、防护服、医用防护帽，靴套)。②检验操作过程尽可能避免打开试管盖，尽可能缩短打开的持续时间，尽可能避免产生气溶胶。③检验操作过程如果必须打开试管盖、或有可能产生气溶胶的操作、或可能接触标本本身，则必须在生物安全柜内进行，试管盖弃去消毒。④检验人员资质及培训：a.新型冠状病毒肺炎的相关常规项目，如血常规、CRP、生化和免疫等检测操作和结果审核人员均应持临床检验资格证上岗。此外，进行新型冠状病毒核酸检测的人员还必须参加临床基因扩增培训，并获得上岗证。b.从事新型冠状病毒肺炎相关检验的检验人员，需接受新型冠状病毒核酸检测技术和相关生物安全培训，考核合格后方能上岗工作。

9.2 新型冠状病毒核酸检测①在分子生物学实验室设置专门的新型冠状病毒核酸提取间(推荐负压实验室，并确保气压符合要求)进行病毒RNA提取，确保生物安全。②进行核酸提取时，呼吸道标本的开盖、取样、核酸的人工提取等操作都在生物安全柜内进行，或完成加样后，转移到全自动核酸提取仪。操作者需三级生物安全防护(医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、防护服、医用防护帽，靴套)。③新型冠状病毒的核酸检测目前采用实时荧光RT-PCR方法，根据新型冠状病毒核酸检测试剂盒推荐操作流程，完成加样和荧光PCR仪扩增、检测。操作者须二级生物安全防护(医用防护口罩、乳胶手套、工作服外隔离衣、医用防护帽)。④结果判读：目前基于实时荧光RT-PCR的新型冠状病毒核酸检测试剂包括单靶标、双靶标、三靶标三大类。引物和探针的设计推荐选用新型冠状病毒的3个特异性区域，开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因。其中ORF1ab区域特异性最高。⑤阳性结果确认：阳性结果重复检测一次，如结果仍阳性，则确认该样本结果阳性。⑥由检测人员完成检测和结果初审，审核者进行结果复核，阴性结果直接报告临床；阳性结果由实验室主任终审后发出阳性报告。⑦阴性结果，不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本采集不合格；样本采集过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等问题。⑧间隔1天的两次核酸阴性结果，是排除新型冠状病毒感染的实验室依据。

表1 单通道试剂结果判读

表2 双通道试剂结果判读

表3 三通道试剂结果判读

9.3 新型冠状病毒肺炎相关的其他检测包括新型冠状病毒血清学检测、血常规、尿常规、C反应蛋白、降钙素原、肝酶、心肌酶、肾功、凝血功能等。①必须在空间相对独立的二级生物安全实验区(室)开展，并按三级防护标准要求做好人员防护(医用防护口罩、双层乳胶手套、面屏/护目镜、防护服、医用防护帽，靴套)。②所有检测按相应检验项目的标准操作流程完成，报告结果。③结果及临床意义：发病早期特异性IgM抗体升高，疾病中期到恢复期特异性IgG抗体4倍升高。发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少，部分患者出现肝酶、肌酶和肌红蛋白增高。多数患者C反应蛋白和血沉升高，降钙素原正常，严重者D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少。重型患者动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，凝血功能异常。

10 检验后标本及相关废弃物处理

①如果血液等标本需复查，应在生物安全柜中重新加盖(新的)，按规定保存，否则和其他固体废弃物一起装入红色废弃物袋内密封，实验室内就地高压灭菌。②相关废液，采用化学消毒或物理消毒方式处理，并对消毒效果进行验证，确保彻底灭活。③消毒灭菌后的标本转运出实验室需符合生物安全原则、符合感染管理规范。

11 生物安全意外事故的处理

①新型冠状病毒标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染：使用有效氯含量为3000 mg/L消毒液，消毒液需要现用现配，24小时内使用。②新型冠状病毒标本造成实验室污染：保持实验室空间密闭，避免不相关人员出入，避免污染物扩散。使用3000 mg/L有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区。必要时(大量溢撒时)可用过氧乙酸加热熏蒸实验室，剂量为 2 g/m3，熏蒸过夜；或 20 g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量 8 ml/m3，作用1～2小时。熏蒸时室内湿度60%～80%。③清理污染物严格遵循活生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。