四妙丸HPLC 指纹图谱建立

夏 婷，陈飞龙，崔媛媛，谭晓梅

（南方医科大学中医药学院，广东省中药制剂重点实验室，广东省中药制剂技术工程实验室，广东 广州510515）

四妙丸由苍术、牛膝、黄柏、薏苡仁组成，收录于2015 年版《中国药典》，用于治疗湿热下注所致的痹病，症见足膝红肿、筋骨疼痛等［1］。其中，苍术主要由挥发性成分组成，以苍术素、苍术醇、白术内酯等化合物为主［2］；黄柏的活性成分为生物碱，小檗碱、黄柏碱、木兰花碱［3-4］；牛膝中主要成分为多糖类、皂苷类、植物甾酮类和黄酮类［5］；薏苡仁的主要成分包括脂肪酸及酯类、薏苡素、糖类、黄酮类、糖蛋白类、甾醇类和内酰胺类等［6］。

目前，四妙丸的指纹图谱研究较少，现有四妙丸指纹图谱存在单波长、分离度差、共有峰与指认峰少、没有对牛膝与薏苡仁药材进行峰归属等问题［7-10］，无法全面表征四妙丸的化学成分。本研究运用HPLC 切换波长法建立了四妙丸指纹图谱，将四妙丸复方进行成分归属；通过相似性评价、聚类分析和主成分分析对11 批四妙丸研究，以期为四妙丸的综合质量评价提供参考。

1 材料

仪器Agilent1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；CP324S 电子天平（德国Sartorius 公司）；KH-500DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。阿魏酸（批号110773-201614）、盐酸小檗碱（批号110713-201814） 均购于中国食品药品检定研究院；巴马汀（批号AF8072606）、黄柏碱（批号AF8062901）、木兰花碱（批号AF8091802）、苍术素（批号AF9030305） 均购于成都埃法生物有限公司；绿原酸（批号16031610）、药根碱（批号16061613） 均购于宝鸡市辰光生物有限公司。乙腈（色谱纯，美国默克公司）；磷酸（色谱纯，上海科密欧有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯；药材信息与11 批四妙丸（规格为每15 粒重1 g） 样品来源信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸，梯度洗脱（0～30 min，7%～18% A；30～45 min，18%～22.5% A；45～50 min，22.5%～24% A；50～55 min，24%～48% A；55～65 min，48%～51%A；65～85 min，51%～70%A；85～90 min，70%～7% A）；波长 （0～65 min，280 nm；65～90 min，330 nm）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；进样量5 μL。

2.2 对照品溶液制备 取绿原酸、黄柏碱、木兰花碱、阿魏酸、药根碱、巴马汀、盐酸小檗碱、苍术素对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成每1 mL 含绿原酸、黄柏碱、木兰花碱、阿魏酸、药根碱、巴马汀、盐酸小檗碱、苍术素各50 μg 的混合溶液，即得。

2.3 四妙丸供试品溶液制备 将四妙丸研成细粉，取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50% 乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声 （300 W，40 kHz） 处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用50% 乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 单味药材供试品溶液制备 按药典中四妙丸比例分别取苍术、牛膝、黄柏、薏苡仁0.15、0.15、0.3、0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50% 乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声 （300 W，40 kHz） 处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用50% 乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一份“2.3” 项下四妙丸供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次，以24 号峰（盐酸小檗碱） 为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于1.5%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批四妙丸样品 （批号190101），按“2.3” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，以24 号峰（盐酸小檗碱） 为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于1.9%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一份“2.3” 项下四妙丸供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，以24 号峰（盐酸小檗碱） 为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于1.7%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6 指纹图谱建立 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版软件对11 批四妙丸样品数据进行处理，生成对照特征图谱；通过对特征峰的识别和指认，得到的四妙丸HPLC 特征图谱共有色谱峰31 个，其中峰6、9、10、16、21、23、24、31 分别与绿原酸、黄柏碱、木兰花碱、阿魏酸、药根碱、巴马汀、盐酸小檗碱和苍术素对照品峰的保留时间相对应，且紫外光谱图一致，混合对照品色谱图与四妙丸样品图见图1。以24 号峰（盐酸小檗碱） 为特征S峰，11 批四妙丸共有峰的相对保留时间及相似度，见表2～3、图2。结果表明，11 批 四妙丸样品相似度大于0.994。对四妙丸样品与单味药进行比较分析，结果见图3，2 号峰来源于牛膝，7、9、10～24 号峰均来源于黄柏，25～31 号峰来源于苍术，6 号峰来源于黄柏和苍术。

图1 各成分HPLC 色谱图

表2 11 批样品共有峰相对保留时间结果

续表2

表3 11 批样品相似度结果

2.7 聚类分析 将11 批样品共有峰的峰面积导入SIMCA 14.1 软件，得到聚类分析图，见图4。11 批四妙丸分为2类，第Ⅰ类包括批号为171107、171108、171211、180111、180112 的样品；第Ⅱ类包括 批号为171111、180603、180901、180717、181218、190101 的样品。聚类分析结果可知，不同批次的四妙丸化学成分含有量存在差异。

2.8 主成分分析 将11 批样品共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件分析软件，结果见表4、图5。表4 显示，1～6 号成分的特征值大于1，累计方差贡献率为95.142%，表明这6 种成分可以反映原始变量的大部分信息，因此，可将其作为主成分进行分析。图5 表明，11 批样品可根据离散程度分为两类。主成分分析结果与聚类分析结果一致，表明不同批次样品间化学成分存在差异。

图2 11 批样品HPLC 指纹图谱

图3 四妙丸各成分归属

图4 11 批样品聚类分析

表4 主成分分析特征值和累计方差贡献值

图5 11 批样品主成分分析

3 讨论与结论

实验通过3D 扫描图得到色谱图在0～65 min 波长为280 nm 得到的色谱峰较多，在65～90 min 波长为330 nm 得到的色谱峰较多，故选用检测波长为280 nm （0～65 min）、330 nm （65～90 min）；考察了不同流动相（水-乙腈、磷酸-甲醇、磷酸-乙腈）、不同柱温（25、30、35 ℃）、不同体积流量（0.8、1.0、1.2 mL／min），最终确定最佳色谱条件。

选用超声提取法，通过考察超声功率 （200、300、400 W）、超声时间（15、30、45 min）、提取溶剂（水、甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、无水乙醇）、溶剂体积（25、50、100 mL） 和取样量（0.5、1.0、1.5 g） 确定了供试品最佳前处理条件。

薏苡仁药理作用的主要成分为油酯类与多糖类［11-12］，目前油酯类的检测技术为蒸发光检测器［13］，多糖的测定采用分光光度法在490 nm 处进行测定［14］。综合考虑四妙丸的整体化学成分，本实验采用HPLC-DAD 检测器建立指纹图谱，该方法尚不能检测到薏苡仁药材的成分。在今后的研究中，可考虑采用多技术、多仪器对四妙丸质量控制进行全面评价研究。

本实验建立四妙丸HPLC 指纹图谱，该方法具有分离效果好，化合物信息丰富，样品处理简单，可用于四妙丸的质量控制。