高橙皮中柠檬苦素超声提取工艺的优化

尤文挺，江 天，王 洒，何 龙，杨诗奕，李云岳

（1.温州医科大学附属温岭医院，浙江 温岭317500； 2.台州市肿瘤医院，浙江 温岭317500； 3.温岭市茗果高橙专业合作社，浙江 温岭317500）

温岭高橙是浙江省温岭市传统的柑橘类品种，早在明代嘉靖《太平县志》 中就有其种植的记载，其栽培历史至少有470 年以上，我国著名园艺学家吴耕民教授曾专门考证并推定它为葡萄柚原生种［1］。温岭高橙果实风味独特、酸甜适中、略带苦味，当地人认为它具有清热降火、醒酒护肝等功效，深受该市及周边地区消费者的喜爱［2］，但在日常食用过程中其果皮和种子往往被丢弃，不仅易造成生态环境污染，更让柠檬苦素这种具有潜在药用价值的生物活性物质白白浪费，造成极大的损失。

柠檬苦素是存在于芸香科、楝科植物中的一类三萜类化合物［3-4］，在柑橘中含有量最高，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗疟疾、抗病毒、抗菌、神经保护、改善骨质量等生物活性［5-6］，随着相关研究的深入，如何从植物中提取该成分也越来越受研究者的关注。超声提取作为一种新技术，它与传统溶剂提取相比可利用超声波产生的搅拌、强烈振动、高加速度、热效应、空化效应等作用来有效破坏植物细胞壁，加速细胞内活性成分进入提取溶剂，从而提高提取效率，缩短提取时间，节约溶剂，并且避免高温对提取成分的破坏［7］。因此，本实验超声提取高橙皮中柠檬苦素，并在单因素试验基础上，采用正交试验对其工艺进行优化，以期筛选出一种高效经济的提取方法，为今后相关工业化应用提供一定的参考。

1 材料

1.1 仪器 DHG-9 423 A 鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；FW-135 植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK2510HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；E-UEC-200I 超声波声强测量仪（杭州成功超声电源技术有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；Waters 2695 HPLC 色谱仪、Waters 2487 紫外检测器（美国Waters 公司）；DU800 紫外／可见光分光光度计（美国Beckman 公司）；BS110S 电子分析天平 （德国Sartorius 公司）；PHS-3C 型精密PH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.2 试剂与药物 新鲜高橙于2015 年12 月由温岭国庆塘高橙场、温岭坞根茗果高橙专业合作社提供，丢弃过度成熟和有损坏者，符合要求者通过手工剥皮并切碎，将皮置于45 ℃干燥箱中干燥至恒定质量，植物粉碎机粉碎，筛选出40～100 目粒度放入密封样品袋中，置于干燥器内保存备用。柠檬苦素对照品（美国Sigma-Aldrich 公司）。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；乙醇、二氯甲烷为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 超声提取在超声波清洗器中进行，最大输入功率为250 W，工作频率为53 kHz。取高橙皮5.0 g，置于250 mL 锥形瓶中，加入适当体积不同体积分数的乙醇，悬空置于离底面3 cm 高度的位置，在53 kHz频率、不同参数下提取。同时，锥形瓶在超声波清洗器自带的温度控制系统中保持对应的恒温，提取后抽滤，滤液在旋转蒸发至无醇味，100 mL 二氯甲烷分3 次萃取，保留并合并二氯甲烷相，45 ℃下旋转蒸发至干，瓶壁残渣用乙腈定容至10 mL，过0.45 μm 疏水膜，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取柠檬苦素对照品10.0 mg，乙腈定容，制成1.0 mg／mL 贮备液，取适量依次稀释成0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg／mL，即得。

2.3 柠檬苦素含有量测定

2.3.1 色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ZORBAX Eclipse Plus C18保护柱（4.6 mm × 12.5 mm）；流动相乙腈-水，等度洗 脱（45 ∶55）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 柠檬苦素HPLC 色谱图

2.3.2 线性关系考察 将 “2.2” 项下对照品溶液在“2.3.1” 项色谱条件下平行进样测定5 次，以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝7 017 548.627X-7 854.429 （R2＝0.999 992），在0.025～1.0 mg／mL 范围内线性关系良好。另外，该方程检测限为1.793 μg／mL，定量限为5.435 μg／mL。

2.3.3 精密度试验 取“2.2” 项下同一对照品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下平行进样测定6 次，每次10 μL，测得柠檬苦素峰面积RSD 为0.61%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.2” 项下同一对照品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下每隔4 h 连续进样测定6 次，每次10 μL，测得柠檬苦素峰面积RSD 为1.7%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批供试品溶液6 份，在“2.2.1” 项下色谱条件进样测定，每次10 μL，测得柠檬苦素峰面积RSD 为2.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 柠檬苦素提取率测定 精密吸取“2.1” 项下供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算提取率，公式为提取率（mg／100 g） ＝C×V／M×100，其中C为柠檬苦素含有量（mg／mL），V为定容体积（mL），M为干燥高橙皮质量（g），平行3 份，取平均值。

2.4 单因素试验 固定乙醇体积分数70%、液料比20 ∶1、提取时间60 min，考察不同功率（150、175、200、225、250 W） 下不同声强 （0.049 5、0.098 6、0.159 5、0.255 6、0.384 0 W／cm2） 对柠檬苦素提取率的影响；固定声强0.159 5 W／cm2、液料比20 ∶1、提取时间60 min，考察不同乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）对该成分提取率的影响；固定声强0.159 5 W／cm2、乙醇体积分数70%、提取时间60 min，考察不同液料比（10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1） 对该成分提取率的影响；固定声强0.159 5 W／cm2、乙醇体积分数70%、液料比20 ∶1，考察不同提取时间（30、45、60、75、90 min）对该成分提取率的影响。

2.5 正交试验 在单因素试验基础上，选择声强（A）、乙醇体积分数（B）、液料比（C）、提取时间（D） 作为影响因素，柠檬苦素提取率作为评价指标，采用L9（34） 正交试验优化提取工艺。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果（n＝3）

表3 方差分析

由表2 可知，各因素影响程度依次为B＞C＞A＞D，即乙醇体积分数＞液料比＞声强＞提取时间；由表3 可知，因素A、B、C有显著影响 （P＜0.05），最优工艺为A2B2C3D3，但由于D无显著影响（P＞0.05），并考虑到时间和成本，故将其修正为A2B2C3D1，即声强0.255 6 W／cm2，乙醇体积分数70%，液料比30 ∶1，提取时间30 min。

2.6 验证试验 按“2.5” 项下优化工艺进行3 批平行验证试验，测得柠檬苦素提取率分别为61.87、59.82、61.01 mg／100 g，平均60.90 mg／100 g，表明工艺合理可行，可大大节约提取时间。

3 讨论

本实验发现，50%乙醇超声提取后高橙干燥皮中微粒会吸附大量提取液而出现膨胀，导致难以过滤，之后旋转蒸发至无醇味的提取液在萃取时出现了乳化现象，使得提取液损耗严重，从而降低了柠檬苦的提取率。相关研究表明［8］，造成上述现象的原因是由于在水比例相对较高的提取液中和超声、加热环境下，果皮组织样品吸水膨胀加剧，果胶提取率显著增加，而提取液中果胶具有良好的乳化能力；在醇比例较高的提取液中（90%），由于果胶溶于水而难溶于乙醇，高体积分数乙醇给提取体系带来的溶解效益越来越小，果胶开始从溶液主体中沉淀下来［9］，附着在高橙皮微粒的表面，阻碍柠檬苦素扩散，导致其提取率急剧下降。因此，合适的乙醇体积分数对于提取率的提高优化至关重要。

液料比对天然药物提取过程具有重要影响，由Fick 扩散第二定律推导出的动力学模型分析可得，液料比较低时，有效成分溶解不充分，溶液过早进入饱和；液料比较高时，有效成分快速溶解，可提高扩散速度［10-11］。在工艺优化过程中发现，相对较小的液料比（10 ∶1） 会导致柠檬苦素在提取液中的含有量相对较高，而与高橙皮细胞液之间的浓度差较小，不利于物质扩散，进而降低提取效率；当液料比增加，浓度差扩大时，可加速柠檬苦素扩散，从而提取率得到改善。

本实验发现，不同功率下声强变化对超声提取高橙皮中柠檬苦素的影响并不占主导地位。一般情况下，超声波清洗器在功率范围内的声强条件下通常可产生稳态空化作用，加上超声的搅拌和传质能力［12］，能有效击破高橙植物细胞壁，加速细胞内容物的释放和提取［13］，从而增加柠檬苦素提取率。然而，研究中超声清洗器功率有限，无法观察到更大声强对提取的影响，可能制约了声强因素对提取的影响程度。

综上所述，本实验优化的高橙皮中超声提取柠檬苦素工艺经济高效，以期为今后相关工业化应用提供一定的参考。