HPLC 法同时测定九龙盘中6 种成分

李 俊，卢汝梅，黎云清，梁臣艳

（广西中医药大学，广西 南宁530200）

九龙盘为蓼科金线草属植物金线草Antenoron filiforme（Thunb） Rob.et Vaut.的全草，具有通气道、谷道，调龙路，清热毒，散瘀止痛之功效。壮族民间常用于治疗埃病（咳嗽）、阿意咪（痢疾）、埃嘞（咳血）、发旺（风湿骨痛）、林得叮相（跌打损伤） 等［1］。研究发现金线草中主要有黄酮类、香豆素、酯类、植物蜕皮甾醇类等，其药理学作用也十分广泛，有抗菌消炎、抗肿瘤、止血、抗病毒、抗氧化等作用［2-5］。研究通过采用显微鉴别和薄层色谱的方法对金线草进行定性鉴别，确定其质量标准［6-8］。且目前主要研究了黄酮类化合物的药理作用。目前对九龙盘的相关研究报道较少，《广西壮族自治区壮药质量标准》 收载了九龙盘的质量标准，但仅有没食子酸的含有量测定［9］，指标成分专属性和相关性不强。李兵等［10］采用HPLC法测定了其中没食子酸的含有量，开展鉴别和检查项目研究，制定九龙盘的质量标准。樊宝娟等［11-12］测定了金线草中β -谷甾醇、胡萝卜苷和没食子酸的含有量，对九龙盘化学成分的质量控制主要表现在单个化学成分的质量控制，不能全面反映药材的整体质量。Zhao 等［13］从金线草中分离鼠李素-3-O-β-D-半乳吡喃苷、豆甾醇、3-β-谷甾醇等11 个化合物。Ma 等［14］从金线草中分离得到1，3-di-O-p-coumaroyl-2′，6′-di-O-acetylsucrose、quercetin 3-O-β-D-apiofuranoyl-（1→2） -α-L-rhamnopyranoside等2 种新的酚类成分和9 种已知化学成分。

近年来，本课题组对九龙盘的化学成分进行研究［15-16］，分离得到没食子酸、圣草酚等22 个化合物；并开展了九龙盘中镇痛抗炎药理作用研究。本实验采用HPLC 法，对前期提取分离得到的没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素和木犀草素6 种成分进行含有量测定，以期为全面评价药材质量，提升药材质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪，DAD检测器（美国安捷伦公司）；UV-1780 型紫外分光光度计 ［岛津企业管理 （中国） 有限公司］；CPA225D 型电子天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；Direct-QR5UV 型自动纯水蒸馏器 （广西南宁市博美生物科技有限公司）；RT-01 型粉碎机（上海罗技机械设备有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司）；水为超纯水，其余试剂为分析纯。对照品没食子酸（批号Y19M8C36143）、原儿茶酸（批号Z30M6L1）、异槲皮苷（批号P25J9F65872）、鞣花酸 （批 号 S02N7G24008）、木犀草 素 （批 号C24M8Q36543，纯度≥98%） 均购自上海源叶生物科技有限公司；槲皮素 （批号150206，纯度≥98%） 购于上海如吉生物科技有限公司。九龙盘药材经广西中医药大学梁子宁教授鉴定为蓼科植物金线草Antenoron filiforme（Thunb） Rob.et Vaut.的干燥全草。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 COSMOSIL 5C18-PAQ 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A） -0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，程序见表2；双波长切换检测；体积流量0.8 mL／min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素粉末适量，分别置于5 mL 量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，制成每1 mL 含6 种成分依次为1.08、1.15、1.08、0.08、1.13、1.10 mg 的对照品贮备液。精密吸取各对照品贮备液适量，置于25 mL 量瓶中，80% 甲醇稀释至刻度，配置成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取九龙盘药材粉碎，过3号筛，称取3 g 粉末，精密加入80%甲醇100 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用80% 甲醇补 足减失 的质量，摇 匀，滤 过。经0.22 μL 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液及其供试品溶液各10 μL，分别测定，结果显示，在“2.1” 项色谱条件下，各待测成分间均能达到基线分离，且分离度均＞1.5，其他成分对待测成分的测定无干扰，色谱图见图1。

2.5 线性关系考察 精密吸取上述不同质量浓度的混合对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样10 μL，以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 精密度试验 精密吸取“2.2” 项下混合对照品溶液10 μL，在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次，得没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素和木犀草素的峰面积RSD 分别为0.8%、1.0%、1.3%、1.9%、1.0%、0.8%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一份样品粉末6 份，按“2.3” 项下方法平行制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素和木犀草素峰面积的RSD 分别为 1.0%、1.0%、1.255%、1.9%、1.0%、0.8%。表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样6 次，测得没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素的峰面积RSD 分别为0.7%、3.0%、1.8%、2.5%、2.4%、1.5%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取同一批药材6 份，每份约1.5 g，精密称定。分别精密加入混合对照品溶液。按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 样品含有量测定 取4 批九龙盘药材粉末，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，每批平行3份。精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进行测定。计算九龙盘药材中6 种成分的含有量，结果见表5。

表5 各成分含有量测定结果（n＝3，mg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents （n＝3，mg／g）

3 讨论

实验中分别考察了不同提取方式（超声、回流）、不同浓度甲醇（80%、70%、60%） 和不同提取时间（60、90、120 min），最终确定以3 g 粉末中加入80%甲醇100 mL，回流提取2 h，色谱峰分离度和峰面积最佳，并作为供试品溶液的制备方法。在检测波长的选择上，分别对6 种成分进行全波长范围扫描，最终确定0～20 min 为260 nm 检测没食子酸、原儿茶酸；20～55 nm 为360 nm 检测异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素；55～60 min 为260 nm检测木犀草素为检测波长。对色谱系统（甲醇-水、乙腈-水）、酸水浓度（0.1%、0.2%、0.3%）、流动相的梯度，体积流量（0.6、0.8、1.0 mL／min）进行考察，最终确定以甲醇-0.2% 磷酸为流动相，体积流量0.8 mL／min 时色谱峰各个待测组分保留时间适中，分离度良好，峰形对称。对不同色谱柱（COSMOSIL 5C18-PAQ、Ruby C18-B） 进行考察，结果显示前者色谱柱分离效果好，且峰型对称。

九龙盘现行的质量标准存在着质量控制指标单一、与药效关联性不强的问题，需要建立与安全性、有效性密切相关的质量控制方法和质量标准。酚酸类化合物在抗氧化、抗菌消炎、降血脂等方面具有很强的药理作用［17］，黄酮类化合物的结构多样性使其具有广泛的药理活性，如调血脂、扩张冠脉、止血、镇咳、祛痰、降低血管脆性、抗菌、保肝、解毒、治疗急慢性肝炎和肝硬化等作用［9］。本课题组前期研究发现九龙盘具有良好的镇痛、抗炎作用，故本研究对前期提取分离得到的没食子酸等酚酸类、黄酮类化合物作为含有量测定指标，符合中药质量标志物（Q-marker） 的选择条件［18-20］。对4 批九龙盘样品进行含有量测定，含有量限度按照平均值下浮约80% 计算，建议没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素的含有量分别 不低于0.700 2、0.035 8、0.072 6、0.272 1、0.512 8、0.054 8 mg／g。本研究建立的方法操作简单，精密度与重复性、稳定性好，专属性强，以期为九龙盘质量控制的研究提供依据。