戊乙奎醚对肺缺血再灌注损伤SP-A的影响及其与HMGB1-RAGE信号通路的关系

张志洋 高满海 赵志英 姜寒薇 李慧君 武建斌

(包头医学院 1第一附属医院，内蒙古 包头 014000；2麻醉学院；3 2015 级麻醉专业本科生)

缺血再灌注导致的肺损伤是休克、肺移植、单侧肺通气及体外循环术后肺功能障碍的重要因素，及时合理防治对减少肺缺血再灌注损伤(LIRI)具有重要临床意义。戊乙奎醚作为一种高选择抗胆碱能药物，已广泛用于麻醉前用药、有机磷农药中毒抢救及改善微循环等方面。近来研究发现，戊乙奎醚在预防和治疗急性肺损伤中有良好的保护作用〔1〕，其通过抑制血清中高迁移率族蛋白(HMG)B1、肺表面活性蛋白(SP)-A的表达，增加支气管肿泡灌洗液(BALF)中SP-A的表达，对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤具有显著疗效〔2〕。但关于戊乙奎醚预处理对LIRI的作用鲜见报道。本研究拟用Wistar大鼠建立LIRI模型，探究戊乙奎醚对LIRI的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1动物及试剂 健康Wistar雄性大鼠120只，体重250～300 g，购于内蒙古大学实验动物中心。盐酸戊乙奎醚注射液批号：20090511-1，购自成都力思特制药股份有限公司。

1.2动物分组和模型制备 将120只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组(S组)、LIRI模型组(LIRI组)、戊乙奎醚低剂量组及高剂量组(P1组及P2组)每组30只。4组均采用1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，参照廖秀清等〔3〕建立的LIRI模型，左侧第5肋间开胸，于呼气末以无损伤血管钳夹闭左肺门，缺血45 min后开放灌注2 h；S组仅游离肺门，但不夹闭；P1、P2组分别于术前1 h静脉注射戊乙奎醚0.3 mg/kg和1.0 mg/kg，S组与LIRI组分别给予等容量的生理盐水。

1.3肺组织湿干质量比 (W/D) 取左肺组织，滤纸吸净表面液体，天平称其湿重后，置于70℃电热恒温干燥箱内，48 h后称其干重，计算W/D。

1.4肺组织病理学观察 取左肺组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肺组织病理学变化。

1.5Western印迹法检测各组肺组织中HMGB1、SP-A蛋白表达 将各组肺组织加入RIPA裂解液裂解细胞，提取上清液。用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品(20 μg/孔)。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为第二抗体，室温孵育1 h，电化学发光法(ECL)显色，以β-肌动蛋白(Actin)为内参，通过凝胶成像系统进行蛋白表达量的半定量分析。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析、LSD法。

2 结 果

2.1各组肺组织病理学观察 显微镜下可见S组肺组织结构清晰；LIRI组肺组织结构破坏严重，肺泡间隔增宽，肺间质充血水肿，有明显的炎症细胞浸润和红细胞渗出，肺部损伤最严重；P1、P2组肺组织结构、肺泡间隔及肺间质充血水肿情况较LIRI组减轻，同时P1组较P2组肺组织损伤轻，见图1。

图1 各组肺组织病理学比较(HE，×100)

2.2各组W/D比较 与S组比较，LIRI组、P1组、P2组W/D显著升高(P<0.05)；与LIRI组比较，P1组、P2组W/D显著降低，且P2组显著低于P1组(P<0.05)，见表1。

2.3各组肺组织中HMGB1、SP-A蛋白表达比较 与S组比较，LIRI组、P1组、P2组肺组织中HMGB1表达显著升高，SP-A表达显著降低(P<0.05)；与LIRI组比较，P1组、P2组HMGB1表达显著降低，SP-A表达显著升高(P<0.05)，且P2组HMGB1表达降低和SP-A表达升高较P1组更明显(P<0.05)，见表1，图2。

表1 各组肺组织W/D值、HMGB1、SP-A 表达比较

与S组比较：1)P<0.05；与LIRI组比较：2)P<0.05；与P1组比较：3)P<0.05

图2 各组肺组织中HMGB1、SP-A蛋白表达

3 讨 论

LIRI是影响术后早期肺功能恢复的关键性因素，其主要特征是发生局部和全身的炎症反应，此类反应可引起多种细胞因子介导的肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的损伤及凋亡〔4〕。

SP-A在促使肺泡炎症消退、抑制AT-Ⅱ的凋亡及降低肺泡表面张力等方面具有重要作用，可预防肺泡萎陷和肺不张〔5，6〕，当肺发生缺血再灌注损伤时会使得该蛋白含量减少。本实验结果与吴畏等〔7〕的研究结果吻合，即当肺发生急性损伤时，可出现SP-A蛋白表达下调，加剧肺部炎症反应，使肺损伤进一步恶化。HMGB1作为重要的晚期炎症因子与晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合，可诱导炎症细胞因子的转录和表达进而引起炎症反应的瀑布效应〔8〕，加重肺泡-毛细血管屏障的损伤，细胞膜通透性增加，SP-A进入血液循环，肺组织中SP-A含量进一步下降。本研究结果提示LIRI可能激活了HMGB1-RAGE信号通路，引起HMGB1的过表达，加剧了肺部炎症反应。Kao等〔9〕、陆建峰等〔10〕研究发现，对急性肺损伤大鼠应用HMGB1抑制剂治疗，可抑制HMGB1蛋白表达上调，从而减轻炎症细胞的聚集和肺水肿，对肺损伤产生保护作用。戊乙奎醚作为新型抗胆碱药，广泛用于器官缺血再灌注损伤的保护，选择作用于M1、M3受体，对肺的保护机制除解除支气管平滑肌痉挛外，还可提高肺组织对缺血缺氧的耐受性，降低肺毛细血管通透性，改善微循环；抑制肺部炎症反应，从而减轻肺水肿并改善通气〔11，12〕。本实验研究结果表明戊乙奎醚对LIRI大鼠肺组织起到保护作用。

本研究发现，肺发生缺血再灌注损伤时可能伴随HMGB1-RAGE信号通路的激活及HMGB1蛋白的过表达。其中，HMGB1-RAGE信号通路与炎症反应密切相关，HMGB1与RAGE结合后使得下游P38MAPK磷酸化和核因子(NF)-κB活化，诱导炎症因子转录表达，产生炎症效应和免疫应答，导致缺血再灌注损伤的发生〔13〕。本研究证明戊乙奎醚有助于减轻LIRI。同时，戊乙奎醚可能阻断了HMGB1-RAGE信号通路，抑制HMGB1的过表达，阻止因炎症因子HMGB1的大量产生和聚集引起的炎症瀑布效应，有利于减轻肺部炎症反应，且戊乙奎醚高剂量组对肺损伤的改善效果优于低剂量组。

综上，戊乙奎醚能够抑制LIRI时HMGB1-RAGE信号通路的激活，增加肺组织中SP-A的表达，对缺血再灌注损伤的肺组织起保护作用。