长链非编码RNA HOTAIR在乳腺癌患者中表达及其临床意义

高洪亮 邢福成

(天津市北辰医院外科，天津 300400)

同源异型框基因翻译基因间RNA(HOTAIR)，是目前研究较为透彻的长链非编码RNA，其在人类多种实体肿瘤中呈现异常表达并可能与患者的预后和肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学行为密切相关〔1,2〕。长链非编码RNA是近年来发现的一类长度在200～100 000 nt之间的RNA分子，该RNA虽然不编码蛋白质，但其通过自身复杂的结构和庞大的种类发挥着包括表观遗传学调控在内的多种生物学调控功能〔3〕。HOTAIR是新近发现的具有较多生物学功能的长链非编码RNA，其参与了多种肿瘤的侵袭转移过程。HOTAIR可在分子层面对乳腺癌细胞组蛋白进行修饰，从而影响其侵袭转移〔4,5〕。但HOTAIR表达水平与乳腺癌患者预后的关系鲜有报道。本研究采用生物信息学分析HOTAIR在多个数据库中的表达及高低表达与患者的预后关系；采用q-PCR法检测乳腺癌患者癌组织中HOTAIR表达情况及其与患者预后的相关性。

1 材料与方法

1.1数据库选择及分析 选取Oncomine(https://www.oncomine.org/)、Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)和TCGA数据库进行相关分析。在Oncomine数据入选限定条件为：乳腺癌；对比乳腺癌组织和正常乳腺组织中HOTAIR的差异表达情况；mRNA为表达水平；差异表达级别(logFC)大于2倍。在Kaplan-Meier Plotter数据检索乳腺癌数据集，计算无疾病进展生存，对肿瘤病理类型、临床分期、分级等不作限制。TCGA数据库选择腺癌，且具有生存分析数据。

1.2组织标本 选择天津市北辰医院2015年1月至2018年12月收治并经手术治疗的乳腺癌患者72例，均为女性，平均年龄(56.8±12.6)岁。患者术前均未接受过放化疗等新辅助治疗。手术标本切除后，立即放入事先准备好的液氮罐中冷冻，再将组织置于-80℃冰箱保存，用于后期提取总mRNA。根据乳腺癌患者HOTAIR在肿瘤组织中表达水平的中位数，分为高表达组与低表达组。

1.3实时荧光定量PCR 采用Trizol试剂对乳腺癌组织、癌旁组织进行裂解，经氯仿混合震荡离心，再经异丙醇沉淀，提取总RNA。应用Takara公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用Toyobo公司的SYBR GREEN MASTER MIX，在ABI 7500 96孔实时荧光定量PCR仪上进行实验，定量检测HOTAIR的表达情况。

1.4统计分析 采用Stata10.0软件进行t检验、χ2检验、生存分析绘制生存曲线并进行log-rank检验。

2 结 果

2.1HOTAIR在乳腺癌中的表达 Oncomine数据库分析显示，HOTAIR在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺组织(P<0.05)，见图1。

A：HOTAIR在多种肿瘤中的表达情况；B:HOTAIR在2个芯片数据集中的表达；C:乳腺癌组织与正常乳腺组织中HOTAIR差异表达的柱状图图1 Oncomine数据库分析HOTAIR在乳腺癌中的表达情况

2.2HOTAIR表达与患者预后 Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示，高低表达组239153_at (HR=1.29,95%CI:0.94～1.76,P>0.05)和1557051_s_at(HR=0.92,95%CI:0.67～1.29,P>0.05)总生存期(OS)差异无统计学意义(P>0.05)，但数据集进行分析239153_at呈现出高表达患者生存期较短的趋势，见图2。

2.3TCGA数据分析HOTAIR HOTAIR在乳腺癌中拷贝数异常率为0.1%， 见图3。而HOTAIR表达水平在各种突变情况下差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图2 HOTAIR高低表达患者OS生存曲线

图3 TCGA数据库中HOTARI表达

图4 HOTAIR在2个数据集中的相对表达水平

2.4q-PCR验证 癌组织中HOTAIR相对表达量(8.36±3.78)显著高于癌旁组织(5.26±3.33，P<0.05)。高表达组生存期显著低于低表达组(HR=1.45,9%CI:1.08～2.32,P<0.05)。

3 讨 论

全球每年新发乳腺癌病例130 万，死亡40 万，乳腺癌已成为继肺癌之后发病率及死亡率最高的实体肿瘤〔6〕。近年来随着分子生物学技术的不断进步，乳腺癌发生、发展、侵袭及转移等多种生物学行为的研究不断深入，越来越多的研究已从分子水平上证实乳腺癌是一种具有一定遗传背景的疾病，患者基因水平上的改变在乳腺癌发生及转移过程中起重要作用，早期乳腺癌可接受手术治疗，预后较好5 年生存率可达90%以上，但已发生转移的乳腺癌预后较差〔7,8〕。因此，探寻乳腺癌发生侵袭、转移的机制、早期发现乳腺癌转移高危人群或高危相关因素，并加以预防和治疗是提高乳腺癌预后的重要途径之一〔9～11〕。

HOTAIR作为长链非编码RNA的重要成员之一，与乳腺肿瘤的发生、发展密切相关。HOTAIR是HOXC基因簇的一条反义链，作为组蛋白修饰复合物的脚手架，其5′端结构域与PRC2复合体结合，3′端结构域与LSD1/CoREST/ REST复合体结合〔12〕。而HOTAIR能同时结合这两个复合体，并将其募集到特异性的基因组位点，从而使该染色体处于封闭状态而使其基因沉默〔13,14〕。Gupia等〔13〕首先采用基因芯片技术对乳腺癌细胞及正常细胞进行长链非编码RNA表达谱的差异选择，发现HOTAIR表达水平明显高于正常乳腺细胞，进一步采用分子克隆技术和microRNA干扰技术将带有HOTAIR基因的表达载体稳定转染乳腺癌细胞(microRNA干扰其表达)发现稳定表达HOTAIR基因的乳腺癌细胞其增殖、侵袭、转移能力明显高于转染前，microRNA干扰后乳腺癌细胞侵袭转移能力明显下降，在细胞学上证明HOTAIR与乳腺癌转移的生物学行为有密切关系。本研究生物信息分析显示HOTAIR高或低表达与患者的预后无关，但其中一个芯片数据集提示高表达患者已呈现总生存期较短的趋势。进一步采用组织标本进行验证，结果提示HOTAIR在乳腺癌中高表达，且与患者预后相关，可作为乳腺癌患者预后潜在的分子标志物。