针刺尿三针对良性前列腺增生大鼠的疗效

黄林 方浩泰 王梓楠 林亨 袁青

(广州中医药大学 1针灸康复临床医学院，广东 广州 510405；2附属湛江第二中医院)

良性前列腺增生症(BPH)是一种非恶性、无调控生长的疾病，由过渡区和尿道周围的上皮细胞和纤维肌组织的结节性过度生长所导致〔1〕。BPH临床症状主要有前列腺体积(PV)增大、下尿路症状(LUTS)、反复泌尿道感染、急性尿潴留等，严重影响患者生活质量。BPH发病率与年龄相关，大约从40岁开始，随着年龄的增长,其发病率呈上升趋势〔2〕。随着全世界人口老龄化，BPH发病率不断增高，BPH不论储尿期症状，还是排尿期症状，均会对患者造成很大痛苦，严重者会引起肾后性肾功能衰竭，危及生命。BPH是一种多因素疾病，雄激素、雌激素、基质上皮相互作用、生长因子和神经递质可能单独或联合在病因学中发挥作用〔3〕。因BPH组织中雄激素和雌激素的作用都有所增强〔4〕，激素水平的改变被多数人认为是其主要原因，又有研究表明，它们对前列腺细胞的作用都是间接的，生长因子才是直接作用的介质，BPH中碱性成纤维生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)-β2这两种生长因子均表达增高〔5〕。本研究对BPH大鼠模型进行针刺尿三针治疗，观察雌激素及相应生长因子表达水平，探讨针刺尿三针对BPH病理过程的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 18只体重250～300 g的成年雄性健康SD大鼠购于南方医科大学实验动物中心〔质量合格证号:SCXK(粤)2016-0041,等级SPF〕。所有大鼠在广州中医药大学青蒿研究所采用分笼饲养，饲养温度为20～26℃，湿度为40%～70%，14 h昼夜间断照明，保持笼内整洁干燥、注意通风换气。喂养选用全价颗粒饲料，自由进食饮水，及时更换垫料。

1.2实验药物 食用橄榄油；丙酸睾酮注射液(规格：1 ml:25 mg)，产品批号：131208，购于上海通用药业股份有限公司；大鼠双氧睾酮(DHT)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、大鼠雌二醇(E2) ELISA试剂盒、大鼠碱性成纤维生长因子(bFGF) ELISA试剂盒、大鼠转化生长因子(TGF)-β2 ELISA试剂盒，均购于武汉华美生物有限公司；水合氯醛AR，购于东巨有限公司。

1.3主要仪器 台式高速离心机，产品批号D3024R，购于赛洛捷克公司；多功能酶标仪，产品批号 DG5033A，购于南京东华电子有限公司；F1移液器，产品批号Finnpipette，购于中国Thermofisher公司。

1.4实验流程

1.4.1运用随机数字表法将18只健康成年雄性SD大鼠分为正常组、模型组、针刺组，每组各6只。

1.4.2造模方法 采取不去势方法，模型组和针刺组以5 mg/(kg·d)丙酸睾酮皮下注射，连续28 d，每日称重后调整丙酸睾酮的注射量；相同时间给予正常组等量的橄榄油皮下注射。造模完成采取单笼喂养，每天保证提供足量的鼠粮、干净的饮用水，及时更换垫料。

1.4.3治疗方法 针刺组于造模后次日起给予针刺干预，每日干预时间固定，将大鼠用固定器固定，选用华佗牌0.18 mm×10 mm的毫针，取“靳三针疗法”中尿三针穴组(中极、关元、三阴交，定位参考文献〔6〕)，中极向下斜刺3 mm，关元向下斜刺3 mm，三阴交直刺3 mm，进针后，模拟在人体操作捻转手法，拇、食指捏握针柄匀速捻转20次，幅度在180°～360°之间，完成后不留针，立刻出针，如针孔有出血则用脱脂棉球按压。针刺干预频率为每日1次，连续21 d。模型组和正常组每天同一时间行空抓,时间为1 min，空抓时模型组大鼠与正常组大鼠均用固定器固定，而不给予针刺干预。见图1。

图1 大鼠空抓与针刺干预

1.4.4取材方法 取材前1天禁食12 h，禁水6 h。针刺干预21 d结束后，大鼠称重后，采取7%水含氯醛(1 ml/kg)注射于腹腔右下部(0.3 ml/100 g)，麻醉成功后，固定于手术台，摘取完整的膀胱与前列腺组织，将周围脂肪清除干净，10%甲醛定大鼠前列腺，石蜡包埋、切片。腹主动脉插管采空腹血5 ml，4℃静置3～4 h，3 000 r/min离心10 min，选取上层血清，于-70℃环境中保存。

1.4.5检测指标及方法

1.4.5.1前列腺指数测定 电子天平测量前列腺组织湿重，公式：大鼠前列腺指数(PI)=前列腺湿重(mg)/大鼠体重(g)。

1.4.5.2ELISA测定大鼠血清DHT、E2、bFGF和TGFβ2水平 (1)依据待测样品加上标准品的数量确定板条数，尽量使用复孔操作。(2)反应孔内加入调配好的标准品、待测样品各50 μl。随即继续加入50 μl经生物素标记的抗体。将膜板盖上，将反应孔内液体振荡至均匀，于37℃空间温育45 min。去除反应孔里的液体，加入洗涤液，振荡30 s，清洗反应孔，用吸水纸拍干。重复此操作4次。假设使用洗板机，则增加1次清洗的次数。(3)每个反应孔内加入100 μl的亲和链酶素，将孔内液体振荡至均匀，37℃空间温育30 min。去除反应孔里的液体，洗涤液加满每个反应孔，振荡30 s，去除洗涤液后用吸水纸拍干。重复此操作4次。假设使用洗板机，则增加一次清洗的次数。每个反应孔分别加入50 μl底物A、B，将孔内液体振荡至均匀，37℃空间温育5 min。避免光照。取出酶标板，立即加入50 μl终止液，测定结果。在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.5统计学方法 采用SPSS21.0软件结合STATA13.0软件分析，多组计量数据的均数比较，经检测符合正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析，组间比较用LSD-t法；方差不齐的数据秩转换后进行方差齐性检验。

2 结 果

2.1实验动物脱落情况 18只SD大鼠无脱落情况，均纳入结果分析。

2.2各组前列腺湿重和前列腺指数 与正常组相比，模型组和针刺组前列腺湿重及前列腺指数均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，针刺针组前列腺湿重及前列腺指数均明显降低(均P<0.05)。见表1。

表1 各组前列腺湿重及前列腺指数比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.3各组激素DHT、E2、bFGF和TGF-β2的表达情况 与正常组相比较，模型组的DHT和bFGF、E2和TGF-β2表达水平明显增加(P<0.05)；与模型组相比较，针刺组DHT和bFGF的表达水平有明显降低(P<0.05)，E2和TGF-β2的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组血清中激素DHT、bFGF、E2 和TGF-β2表达水平的比较

与模型组比较：1)P<0.05

3 讨 论

BPH是中老年男性的常见病，特征是前列腺上皮和基质组织的异常增生，严重影响中老年人生活质量。西方医学在BPH 临床治疗手段方面最有效的方法是手术，但手术对于老年人来说存在较多风险。运用针刺方法治疗本病具有起效时间快、经济安全、病人接受度高等优点。

本实验与常用BPH大鼠造模方法不同，采用的是不去势的情况直接皮下注射丙酸睾酮来建立动物模型，考虑到去势后再皮下注射丙酸睾酮造模方法因大鼠睾丸被去除，雄性激素分泌会大量减少，将打破雌/雄激素水平在大鼠体内的生理性平衡，故不去势的造模方法更有利于本研究结果的科学性，同时也证实本研究设想雄激素含量的升高是刺激前列腺增生的必要条件〔7〕。模型组的前列腺湿重与前列腺指数均显著高于正常组，提示造模成功。

BPH的病因有多种说法，如激素失衡、代谢综合征、年龄和慢性炎症，然而，其病因尚不清楚。在这些因素中，雄激素水平的增加被认为与BPH发病机制关系最密切，雄激素在前列腺的发育和分化中起中心作用，去势大鼠给予外源性雄激素后，萎缩的前列腺组织恢复生长，另外临床治疗BPH的用药思路为阻断雄激素信号通路，如非那雄胺为临床治疗BPH的常用药，由此也可推断雄激素与前列腺的生长发育关系密切〔8〕。前列腺组织内的主要雄激素为DHT，DHT属于睾酮(T)的代谢产物，DHT能刺激前列腺腺体的组织增生，进而引起一系列下尿路梗阻的症状〔9〕。5α还原酶于前列腺间质中具有较高活性,它能将T转化为DHT。DHT的效能是T的5倍,DHT作用于前列腺必须与雄激素受体(AR)结合,AR是胞核受体,起转录因子的作用，并控制各种靶基因的表达，AR与DHT的结合能够调节bFGF而对前列腺间质和上皮细胞的生长产生刺激作用，从而导致前列腺间质异常生长〔10〕。

BPH的性激素失衡并不只是由雄激素的变化引起的，雌激素在前列腺增生过程中也发挥作用,其中最主要、活性最强的激素是E2。研究认为〔11〕，雄激素通过局部基质芳构化产生的雌激素参与了平滑肌细胞的生长和分化，才导致BPH的发生。引发的机制可能通过两种途径〔12〕：①雌激素产生作用是通过促进垂体催乳素分泌；②可提高前列腺内AR表达水平,而这两者的增加均能增强雄激素作用。基于这些观察，抗雌激素特别是芳香化酶抑制剂已被用于治疗BPH引起的下尿路症状。然而，使用芳香化酶抑制剂的大规模、三期随机临床试验一直令人失望，因此没有采用这种方法。

在BPH组织中雌、雄激素表达水平均出现不同程度的增高，bFGF和TGF-β2相应增高。TGF-β2的表达水平随着雌激素增强而出现显著增高,bFGF表达无变化趋势〔5〕。生长因子才是直接促进前列腺细胞的发育、分化的介质，雌雄激素属于间接起作用。生长因子是细胞增殖、分化的重要递质，前列腺细胞生长、死亡等也与其有密切的关系。

BPH在中医属于“精癃”、“癃闭”范畴，运用中医药方法在治疗BPH中效果显著。本研究选用“尿三针”为岭南针灸名家靳瑞教授创立的靳三针疗法中的穴组，以中医基础理论与黄帝内经，总结古今针灸临床经验和研究成果，通过多年的临床验证和实验研究的结果整理而来。“尿三针”治疗BPH引发的症状，尤其是对尿频、尿不尽、尿潴留等都有十分理想的疗效。中医理论认为，BPH是因年迈气血亏虚，肾气、肾阳日渐衰弱，肾脏温煦、气化功能减退，或脾气虚弱，升清降浊调，导致水湿泛滥，或情志不舒，肝气郁滞，影响三焦气化及水液运行，病位主要在肾与膀胱，也跟脾、肝二脏有关。足太阳膀胱经与足少阴肾经互为表里属络关系，膀胱是贮存和排泄尿液的器官，尿液的生成排泄有赖于脾的升清降浊、肝气舒畅及肾气的蒸化作用。各脏腑功能紊乱则出现尿液失常症状，治疗原则应为补益肾气为主，兼以调补益脾胃、调畅气机。“尿三针”穴组由中极、关元和三阴交组成。中极为任脉穴位，又是足太阳膀胱经募穴，凡膀胱功能失职皆可选用，有舒畅膀胱气机的作用，可推动膀胱收缩而排尿。关元穴是人体真气、元气发生之地，是人之根本，具有补益肾气、温阳补肾的作用，可促进肾气的蒸腾气化作用。三阴交为足三阴经交汇之处，可同时调节肝、脾、肾三经气血，治疗尿频、癃闭等病症效果佳。此穴组可起到调补肾气，温煦肾阳，疏导肝脾气机，而有效治疗BPH。

本研究前列腺湿重及前列腺指数方面结果提示一定剂量的外源性雄激素可促使大鼠的前列腺增生，针刺尿三针穴组可以有效地抑制由DHT所致大鼠前列腺增生症所引起的泌尿器官重量的指数升高。

组织学方面，BPH的特征是尿道周围的腺体和间质组织存在进行性增生，并伴有过度的结节性生长，bFGF介导雄激素刺激前列腺组织增生，可以增强BPH中涉及的细胞生长和新生血管的形成〔13〕，组织增生程度与bFGF浓度的增加相关。本研究结果表明大鼠前列腺性增生可由雄激素引起，雄激素具有上调间质细胞中 bFGF表达的作用，不断增多的间质细胞在DHT作用下又不断产生bFGF，诱导前列腺上皮细胞的生长和分化〔14〕。本研究结果表明针刺尿三针穴组可以有效降低BPH 大鼠的DHT水平，进而减少bFGF的分泌，从而达到抑制前列腺增生的作用。在细胞异常增殖过程中所涉及的生长因子的鉴定对于理解BPH的发生机制具有重要意义。事实上，抑制与前列腺增生有关的生长因子或其受体的合成或活性，对前列腺病理的预防和治疗具有重要意义。与正常组相比，BPH SD大鼠中雌激素水平有所升高，影响TGF-β2表达水平也相应升高。与模型组相比，针刺组E2和TGF-β2的表达水平从数值上看是有降低的，针刺“尿三针”穴组对降低BPH大鼠E2效果不明显，考虑由于男性体内雌激素有70%来自雄激素在外周的芳香化作用转变而来〔15〕，模型组和针刺组每天都注射雄激素，部分外源性雄激素转化成了雌激素，雌激素在BPH的维持中起到了一定作用，而不是诱发，同时雌激素受体在BPH组织中的含量极微，不发挥重要作用〔16〕，故针刺组对降低雌激素效果不明显。针刺“尿三针”穴组后，雄激素水平明显下降。因此，针刺“尿三针”穴组主要通过降低BPH 大鼠前列腺组织中DHT、bFGF的表达水平，从而抑制前列腺组织的增生，达到治疗前列腺增生的疗效。