姜黄素抑制白细胞介素8诱导的血管内皮细胞迁移的分子机制

王晓寒 赵旭 广东

(1河南护理职业学院，河南 安阳 455000；2大庆市大庆油田总医院胸外科)

当机体处于病理状态时，如转移性肿瘤、原发性肿瘤、微动脉瘤和海绵状血管畸形，血管提供的营养不能满足肿瘤的迅速生长时，血管生成相关因子大量产生并促进形成新生血管〔1，2〕。而血管内皮细胞迁移在血管生成中起关键作用，通过血管内皮细胞的迁移和增殖可在原有血管的基础上以芽生或非芽生方式形成新血管〔3〕。新生血管形成是肿瘤生长的必要条件，血管内皮生长因子(VEGF)能够诱导血管内皮细胞迁移，促进新生血管形成〔4〕。姜黄素(CUR)是一种从姜黄中提取的天然疏水性多酚，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用〔5〕，对风湿性关节炎〔6〕、胰腺炎〔7〕等疾病的治疗具有良好的效果。研究表明〔8，9〕，CUR通过调节肿瘤坏死因子α、白细胞介素(IL)等炎性细胞因子水平，减轻缺血/再灌注损伤，从而对心、肾、肝等器官损伤发挥保护作用。本文拟探讨CUR对IL-8诱导血管内皮细胞迁移的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 HUVECs人脐静脉血管内皮细胞(批号：PCS-100-010)购自ATCC；CUR(批号：207-280-5)购自湖州浦瑞生物医药技术有限公司；PD98059(简称PB，批号：T2623)购自美国TargetMol公司；胎牛血清(批号：10099-141)、胰蛋白酶(批号：25200056)、RPMI1640培养液(批号：61870044)购自美国Gibco公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(批号：PC0020)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批号：BSP0161)、电化学发光液(批号：PE0030)、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(批号：R0020)、结晶紫(批号：C8470)、4%多聚甲醛(批号：P1110)、二甲基亚砜(DMSO，批号：D8370)购自Solarbio公司；Transwell小室(批号：BD-353502)购自北京明阳科华生物技术有限公司；兔抗人β-actin多克隆抗体(批号：XFC1655)购自上海信帆生物科技有限公司；VEGF兔多克隆抗体(批号：ABP57460)、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2多克隆抗体(批号：ABP51299)购自武汉艾美捷科技有限公司；磷酸化(p)-ERK兔多克隆抗体(批号：ab77654)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自Abcam公司；荧光显微镜购自上海炳宇光学仪器有限公司；MCO-18AC型CO2培养箱购自日本SANYO公司。

1.2细胞培养 使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，2 d换液一次。待细胞生长至对数期，加入胰酶消化并吹散成单个细胞，以1×105个/孔接种于24孔板，随机分为对照(Control)组、IL-8 50 ng/ml组、IL-8 100 ng/ml组、IL-8 200 ng/ml组、IL-8组、IL-8+CUR 15 ng/ml组、IL-8+CUR 30 ng/ml组、IL-8+CUR 45 ng/ml组、IL-8+DMSO组和IL-8+PD组。处理方法：IL-8 50 ng/ml组在细胞培养液中加入浓度为50 ng/ml的IL-8；IL-8 100 ng/ml组细胞培养液中加入浓度为100 ng/ml的IL-8；IL-8 200 ng/ml组细胞培养液中加入浓度为200 ng/ml的IL-8；IL-8组经浓度筛选后，100 ng/ml IL-8效果最佳，用于后续实验并记为IL-8组；IL-8+CUR 15 ng/ml组在细胞培养液中加入100 ng/ml IL-8和15 ng/ml CUR共同孵育；IL-8+CUR 30 ng/ml组在细胞培养液中加入100 ng/ml IL-8和30 ng/ml CUR共同孵育；IL-8+CUR 45 ng/ml组在细胞培养液中加入100 ng/ml IL-8和45 ng/ml CUR共同孵育；IL-8+PD组在细胞培养液中加入100 ng/ml IL-8和50 μmol/L的PD；IL-8+DMSO组在细胞培养液中加入100 ng/ml IL-8和与PD等量的DMSO。

1.3Transwell小室检测细胞迁移 使用不含血清的RPMI1640培养液稀释Matrigel并加入到Transwell小室上室膜上，37℃ 孵育30 min，制成与细胞基底膜类似的一层膜。将上述各组细胞饥饿培养12 h，加入胰酶消化细胞，离心收集并计数，制成浓度为1×106个/ml的细胞悬液并接种于上室。下室中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，将上室放入下室中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h。磷酸盐缓冲液洗涤并用棉签轻轻擦去上层未迁移细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并随机选取6个视野拍照，计数取平均值。

1.4Western印迹 取Control组、IL-8组、IL-8+CUR 15 ng/ml组、IL-8+CUR 30 ng/ml组、IL-8+CUR 45 ng/ml组、IL-8+DMSO组和IL-8+PD组细胞，加入RIPA细胞裂解液于冰上裂解30 min，4℃，10 000 r/min离心15 min取上清。BCA试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后将蛋白样品电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入VEGF(1∶500)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗体，4℃孵育过夜；洗膜后加入HRP酶标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min，电化学曝光显影。

1.5统计学分析 每组实验重复3次，采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1IL-8促进HUVECs细胞迁移 IL-8 50 ng/ml组、IL-8 200 ng/ml组、IL-8 100 ng/ml组的HUVECs细胞迁移〔(239.21±19.56)个、(356.78±39.26)个、(460.87±41.26)个〕显著高于Control组〔(129.46±13.86)个〕。且IL-8 100 ng/ml组通过Transwell小室膜上迁移孔的细胞数最多(P<0.05)；选取100 ng/ml IL-8用于后续实验。

2.2CUR抑制IL-8诱导的HUVECs细胞迁移 对比Control组〔(133±14)个〕，IL-8+CUR 15 ng/ml组〔(332±35)个〕、IL-8+CUR 30 ng/ml组〔(276±26)个〕、IL-8+ CUR 45 ng/ml组〔(193±18)个〕能够显著促进HUVECs细胞迁移(P<0.05)，IL-8+CUR 30 ng/ml、IL-8+CUR 45 ng/ml组显著低于IL-8 CUR 15 ng/ml组(P<0.05)。

2.3CUR抑制IL-8诱导的VEGF表达 与Control组(0.51±0.06)相比，IL-8组可显著上调HUVECs细胞中VEGF蛋白表达(0.75±0.07,P<0.05)，而IL-8+CUR 15 ng/ml、IL-8+CUR 30 ng/ml和IL-8+CUR 45 ng/ml组能够浓度依赖性抑制IL-8诱导的VEGF蛋白表达(0.65±0.07,0.31±0.04,0.33±0.05)，且IL-8+CUR 30 ng/ml、IL-8+CUR 45 ng/ml组显著高于IL-8+CUR 15 ng/ml组(均P<0.05)，见图1。

2.4CUR抑制IL-8诱导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路激活 各组ERK1/2蛋白表达水平无明显变化，而IL-8组细胞中p-ERK蛋白表达显著上调(P<0.05)，而经CUR处理后pERK蛋白表达水平较IL-8组显著降低(P<0.05)。见表1，图2。

1～5:Control组、IL-8组，IL-8+CUR 15 ng/ml组，IL-8+CUR 30 ng/ml组，IL-8+CUR 45 ng/ml组；图2同图1 HUVECs细胞中VEGF蛋白表达

组别ERK1/2p-ERK1/2Control 组1.35±0.090.65±0.05IL-8组1.33±0.130.89±0.091)IL-8+CUR 15 ng/ml组1.28±0.140.84±0.052)IL-8+CUR 30 ng/ml组1.35±0.120.71±0.062)IL-8+CUR 45 ng/ml组1.32±0.140.73±0.072)F/P值0.158/0.9556.722/0.007

与Control组比较：1)P<0.05；与IL-8组比较：2)P<0.05

图2 Western印迹检测HUVECs细胞中ERK1/2和 p-ERK1/2的表达

2.5PD对IL-8诱导的HUVECs细胞迁移和VEGF表达的影响 对比Control组，IL-8可显著促进HUVECs细胞迁移及细胞中VEGF蛋白表达(P<0.05)，加入MAPK/ERK信号通路抑制剂处理后，细胞迁移率及细胞中VEGF蛋白表达水平降低(P<0.05)。见表2，图3。

表2 PD抑制IL-8诱导血管内皮细胞迁移和 VEGF蛋白表达

与Control组比较：1)P<0.05；与IL-8+DMSO组比较：2)P<0.05

3 讨 论

IL-8主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，在肿瘤发生发展中起重要作用〔10，11〕。据报道〔12〕，IL-8能够促进肺癌细胞增殖和转移，增强细胞耐药性，并通过诱导肿瘤血管生成促进肺癌发展。IL-8通过与细胞表面G蛋白耦联受体CX趋化因子受体(CXCR)1和CXCR2结合发挥作用：IL-8与内皮细胞表面CXCR1和CXCR2受体结合，促进内皮细胞收缩，增大血管通透性，诱导内皮细胞迁移〔13〕。此外，IL-8与受体结合可导致蛋白激酶B磷酸化、肌动蛋白形成和细胞骨架重构，为内皮细胞的迁移做好准备〔14〕。MAPK/ERK信号通路在细胞增殖、分化及迁移等多种生理过程中起关键作用，研究表明〔15〕，使用PD抑制MAPK/ERK信号通路可下调VEGF表达，抑制肿瘤血管生成。并且已有证据表明〔16，17〕，激活MAPK/ERK信号通路可上调IL-8表达，促进细胞迁移；抑制ERK1/2磷酸化则减少IL-8的产生。本研究以100 ng/ml IL-8增强HUVECs细胞的迁移能力和VEGF和p-ERK1/2蛋白表达能力；加入PD可显著抑制IL-8诱导的HUVECs细胞迁移和VEGF表达。

姜黄为姜科，属多年生草本植物，广泛分布于我国广东、福建、云南等地，以根茎入药可用于治疗跌打损伤、胸腹胀痛、月经不调等症；CUR是姜黄的主要活性成分，可用于心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等多种慢性病的治疗〔18，19〕。据报道〔20〕，CUR可通过调节细胞增殖、凋亡、转移，抑制血管生成和逆转细胞耐药性对乳腺癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤发挥抑制作用。Yang等〔21〕研究发现，CUR能够通过调节细胞周期蛋白B1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、VEGF等蛋白表达，抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和肿瘤血管生成；Yoysungnoen等〔22〕使用CUR治疗肝癌异种移植模型小鼠后，其血管生成标志物环氧化酶-2和血清VEGF水平显著降低，新生毛细血管密度显著降低。血管生成在肿瘤发展进程中起着至关重要的作用，而血管内皮细胞迁移是新生血管形成的基础；血管细胞向外迁移并在新生组织中增殖，形成新的血管网，为新生组织提供血液供应〔23，24〕。研究证实〔25〕，姜黄素能够延缓乳腺癌肿瘤生长，降低VEGF表达并减少血管生成。本研究显示CUR可明显抑制IL-8诱导的HUVECs细胞迁移。