miR-126表达水平与CXCR4及直肠癌患者临床病理特征之间的相关性

李天梁 徐亮 李蜀华 冷尉

(1西南医科大学附属医院普外科，四川 泸州 646000；2自贡市第一人民医院普外科)

直肠癌是一种临床较为常见的消化道恶性肿瘤，主要发生于齿状线和直肠乙状结肠交界处。直肠癌具有转移性及高复发性的特点，因此晚期直肠癌患者的预后未得到明显改善。

直肠癌的发生发展与诸多因子、信号通路密切相关，目前临床医学尚未将直肠癌的发病机制研究透彻，对直肠癌的分子发病机制进行深入研究，对改善直肠癌患者疗效和预后具有重要意义。CXCR4与某些特定的miRNAs具有调控关系，从而对肿瘤转移产生影响。本研究拟分析微小RNA(miR)-126的表达水平与CXCR4及直肠癌患者临床病理特征之间的相关性。

1 材料和方法

1.1研究对象 选取2010年1月至2016年3月92例西南医科大学附属医院直肠癌手术病人切除标本及距切缘远端5 cm以外正常组织标本，均手术分离并在术后立即置于液氮中保存。

纳入标准：所有患者临床病历资料齐全，术前未接受过放疗、化疗等相关治疗。排除标准：病历资料不全患者；并发其他恶性肿瘤患者；肾、肺等器官衰竭或功能不全患者。本研究所有患者及家属知情，签署知情同意书，并获得该院伦理委员会批准。直肠癌患者平均年龄(61.4±12.4)岁；分化程度：高分化19例(20.65%)，中分化56例(62.22%)，低分化17例(18.48%)。

主要试剂：兔抗大鼠miR-126抗体(Invitrogen公司)；兔抗小鼠CXCR4抗体(Hyclone公司)；PCR缓冲液(Selleck公司)；MgCl2溶液(Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，Dako公司)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白缓冲液(Gibco 公司)；TBST液(Amresco公司)；枸橼酸缓冲液(天根生化科技有限公司)；山羊血清(BD公司)。

1.2方法

1.2.1标本制作 取收集的直肠癌组织及癌旁正常组织，使用4%中性甲醛固定，并进行常规石蜡包埋，厚度为3 μm，连续切片作免疫组化标记。

1.2.2应用qRT-PCR技术检测CXCR4 mRNA的表达水平 依次加入2.5 μl的稀释10倍的PCR，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl上游引物和下游引物，最后加水配成总体积为25 μl的反应体系。在94℃环境中1 min；55℃环境中反应1 min；72℃环境中反应1 min，进行35个循环，72℃环境中反应延长5 min，重复最少三次。采用2-△△Ct方法计算CXCR4 mRNA表达水平。

1.2.3Western印迹法检测miR-126、CXCR4蛋白表达 使用PBS液清洗标本三次，分离缓冲液之后裂解0.5 h，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，加入适量SDS-PAGE蛋白缓冲液后电泳10 min，在10%的牛奶中浸泡电转膜，摇床上常温封闭1.5 h；与一抗结合之后使用TBST进行稀释，并孵育、保存；次日使用TBST液进行清洗，与二抗结合后常温孵育1 h，再次清洗，加入显影剂显色，对miR-126、CXCR4相对表达量进行检测。

1.2.4免疫组化染色 对待测标本进行脱蜡、水化等处理之后，将其在0.01 mol/L、95℃的枸橼酸缓冲液中浸泡，并进行热修复，并在3% H2O2的环境下进行培育，10 min后滴入山羊血清进行封闭，在25～27℃的环境下孵育0.5 h，之后将封闭液抽离，加入一抗，将其置于5℃的环境中过夜培养，次日加入二抗，并在恒温箱中培养0.5 h(恒温箱温度37℃)，使用PBS冲洗后进行二氨基联苯胺(DAB)显色、脱水、封片处理，最后进行镜检。由该院专业医师进行阅片。使用PBS替代一抗为阴性对照，阳性对照则使用阳性切片。按照标本染色程度评分：强染色：3分；中染色：2分；弱染色：1分；无染色：0分。按照染色细胞比例评分：<5%：0分；≥5%且<25%：1分；≥25%且<50%：2分；≥50%且<75%：3分；≥75%：4分。计算两项评分的总分，(-)：0分；(+)：1～2分；()：3～5分；()：6～7分。

1.3统计处理 采用SPSS21.0软件，计量资料两组间比较实施独立样本t检验。多因素回归分析中，因变量为连续型变量时采用多重线性回归模型，因变量为二分类变量时采用Logistic回归模型。

2 结 果

2.1miR-126蛋白及CXCR4 mRNA在癌组织、癌旁组织中的表达对比 直肠癌组织中miR-126蛋白表达(0.15±0.03)明显低于癌旁组织(0.35±0.07)，差异具有统计学意义(P<0.05)；直肠癌组织中CXCR4 mRNA表达(0.56±0.06)明显高于癌旁组织(0.12±0.02)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2直肠组织中CXCR4蛋白的表达 直肠癌组织中CXCR4蛋白表达高于癌旁组织，见图1。CXCR4在直肠癌组织细胞质中大量表达，而在正常的直肠组织中呈不表达或弱阳性表达状态，见图2。

1：直肠癌组织；2：癌变组织图1 CXCR4蛋白在直肠癌组织中的表达

2.3miR-126、CXCR4表达与直肠癌临床参数的关系 miR-126、CXCR4表达与直肠癌患者性别、年龄无关，与直肠癌患者肿瘤体积、病理分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移有关，肿瘤体积较大、Ⅲ+Ⅳ期、分化程度较低、有淋巴结转移、有远处转移患者miR-126表达明显降低，CXCR4表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4直肠癌患者预后多因素Logistic回归分析 肿瘤体积、miR-126表示、CXCR4表达、病理分期、分化程度、淋巴结转移及远处转移等为直肠癌患者预后的影响因素，其中miR-126、CXCR4表达为直肠癌患者预后的独立预测因素。见表2。

表1 miR-126、CXCR4表达水平与直肠癌临床参数的关系

表2 直肠癌患者预后多因素Logistic回归分析

3 讨 论

miR-126是miRNAs的重要组成部分，本研究表明，直肠癌细胞中miR-126能够通过调控靶基因CXCR4，进而起到抑制直肠癌细胞发展的作用。

临床研究表明，miR-126在宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈异常低表达〔1〕。本研究结果说明miR-126的表达可能与直肠癌的发生发展具有密切联系，在直肠癌的发生、转移过程中起到关键作用。但是，目前医学界对miR-126表达与直肠癌发生发展的相关性具有一定争议，有学者研究显示，miR-126的异常表达与直肠癌的发生发展并无必然联系〔2〕。Santarelli等〔3〕发现，miR-126在恶性胸膜间皮瘤中呈现异常低表达，但是miR-126的表达变化与临床病理分期无相关性。还有学者对结肠癌中miR-126表达进行检测，得出miR-126异常低表达与肿瘤分期及远处转移无相关性的结论〔4〕。

miRNAs能够对恶性肿瘤的发生发展、转移等生物学行为产生影响。miR-126能够靶向调控VEGF、CXCR4、PIK3R2等靶基因，从而起到抑制癌细胞转移、扩散的作用。此外，研究发现在直肠癌细胞中miR-126通过调控IRS-1的表达对AKT和ERK1/2信号通路造成影响〔5〕。袁丽倩等〔6〕发现，CXCR4在大肠癌中呈现异常高表达，其表达水平的变化对大肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力造成一定的影响，与肿瘤转移、复发等密切相关。CXCR4在直肠癌中呈现异常高表达，且其表达的变化与恶性肿瘤的发展、转移及患者预后具有一定相关性。葛新等〔7〕在研究中发现，SDF-1/CXCR4信号通路与恶性肿瘤的发展和转移密切相关。本研究结果显示，CXCR4在直肠癌中呈现异常高表达，因此推测CXCR4的表达变化可能与直肠癌的发生发展具有一定相关性，而且CXCR4表达与直肠癌病理特征具有一定相关性，与直肠癌的发展、转移密切相关。大量临床研究表明，miRNAs的异常表达对乳腺癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤的发展和预后具有一定的预测价值〔8～10〕。近年来，许多专家学者致力于miR-126与恶性肿瘤发展之间关系的研究，得出miR-126的异常表达与乳腺癌、恶性间皮瘤、肝细胞癌、非小细胞肺癌及成人T细胞白血病等恶性肿瘤患者的预后具有一定相关性的结论〔11～15〕。本研究也认为miR-126、CXCR4表达为直肠癌患者预后的独立预测因素。SDF-1/CXCR4信号通路对癌细胞的侵袭、迁移具有一定的调控作用，因此本研究推测miR-126表达与直肠癌患者预后的相关性可能是由于miR-126靶向调控CXCR4表达导致的。

综上所述，miR-126在直肠癌中呈异常低表达、CXCR4蛋白在直肠癌中呈异常高表达，二者与直肠癌病理特征具有一定相关性，是直肠癌患者预后的独立预测因素。