刺梨GGP和DHAR基因序列多态性及其与果实维生素C含量的关联分析

李广贵 林国都 胡玉乾 张怀山 白静 安华明 鲁敏

摘要：高含量的维生素C是刺梨果实的重要性状，挖掘与维生素C含量相关联的基因序列变异及单倍型对刺梨的品种改良具有指导意义。在21份野生刺梨资源中对GGP和DHAR基因进行PCR扩增和测序，分析基因序列多态性及其与果实维生素C含量的相关性。GGP基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为2 035 bp的同源序列，其中包含22处变异位点，产生15种单倍型，在0.01显著性水平上，3个单核苷酸多态性（SNP）及Hap15与刺梨果实高含量维生素C相关;在0.05显著性水平上，3个SNP及Hap7与刺梨果实低含量维生素C相关;GGP基因单倍型存在网状进化。DHAR基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为1 609 bp的同源序列，其中包含69处变异位点，产生9种单倍型，在0.05显著性水平上，8个SNP、9个InDel及Hap9与刺梨果实中低含量维生素C相关，1个SNP及单倍型Hap4～Hap6与刺梨果实中高含量维生素C相关;DHAR基因单倍型呈现扇形进化。GGP基因具有更高的单倍型多样性，DHAR基因具有更高的DNA多态性;GGP基因特异单倍型Hap15和DHAR基因特异单倍型Hap4共同存在于刺梨中时，可以使果实维生素C含量表现为高的状态;而GGP基因特异单倍型Hap7和DHAR基因单倍型Hap9同时存在于刺梨中时，可以使果实维生素C含量表现为低的状态。

关键词：刺梨;维生素C;GGP基因;DHAR基因;基因序列多态性;单倍型;关联分析

中图分类号： S661.203.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）08-0063-07

收稿日期：2019-03-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：31660558）;贵州省大学生创新创业训练计划（编号：2018053）;贵州大学SRT计划（编号：2018244）。

作者简介：李广贵（1996—），男，贵州六盘水人，主要从事刺梨分子育种研究。E-mail：1119366514@qq.com。

通信作者：鲁 敏，博士，副教授，主要从事果树生物技术与遗传育种研究。E-mail：48181266@qq.com。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）为蔷薇科蔷薇属植物，原产于中国，因果实富含维生素C而成为研究维生素C代谢的热门材料。研究表明，在所有合成路径中，L-半乳糖途径的GDP甘露糖表异构酶（GME）基因的表达变化最能反映维生素C积累速率的变化;超量表达RrGME基因的拟南芥叶片中维生素C平均浓度提高了6.2倍;而循环途径的脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）基因的表达变化与维生素C的积累变化相似性最高，超量表达RrDHAR的拟南芥叶片中维生素C平均浓度提高了9.7倍[1]。笔者所在课题组研究发现刺梨中L-半乳糖途径的半乳糖醛酸内酯脱氢酶（GLDH）和GDP半乳糖磷酸化酶（GGP）基因的表达特点与维生素C积累高度一致，进一步将它们在烟草中过量表达使烟草叶片中的维生素C含量分别提高了1.1倍和20倍[2-4]。从受体植物维生素C含量的增加程度来看，RrGGP和RrDHAR等2个基因应优先当选为刺梨维生素C代谢的关键酶基因，但有关它们在基因序列上的差异与维生素C含量之间的关联关系并不清楚。

关联分析（association analysis）是一种以连锁不平衡为基础，研究群体基因型多态性与表型变异相关性，发掘和定位基因，并对基因及其等位基因进行功能分析的重要工具[5]。根据扫描范围，关联分析可分为全基因组和候选基因2种途径。汤佳乐等利用70对覆盖全基因组的SSR引物，发现了与猕猴桃叶片及果实中的维生素C含量关联的5个优异标记位点[6]。笔者所在课题组虽然前期也开发了大量SSR引物[7-11]，但由于缺乏刺梨遗传连锁图谱数据，因此在SSR引物的选择上具有随机性，目前尚未筛选到与刺梨维生素C含量相关联的SSR标记位点。针对这种现状，候选基因关联分析是更适合刺梨的研究策略。而在苹果上已有研究证明，GGP基因内的单核苷酸多态性（SNP）是影响果实维生素C含量的主要决定因素[12]。因此，本研究对候选基因RrGGP和RrDHAR进行基因序列多态性分析，并进一步与维生素C含量进行关联分析，为刺梨遗传改良提供理论依据和分子工具。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2017、2018年8—9月进行。从贵州省11个县（市）采样20份，四川省冕宁县采样1份（表1），样本间距离大于50 m。每个采样株均有全球定位系统（GPS）定位，并详细记录经度、纬度、海拔高度。每株采取幼嫩叶片和成熟度及大小一致的有代表性的果实，以株为单位装入做好标记的自封袋中，放在冰盒內，及时带回实验室，经液氮处理后于-70 ℃超低温冰箱中冷冻保存，备用。

1.2 DNA提取和PCR扩增

试验材料基因组DNA的提取采用CTAB法[13]。GGP基因扩增引物序列为正向5′-CATGCCATGGATGTTGAGGATCAAGAGGGTTCCCACTAT-3′，反向5′-GCTCTAGAACATAAACCCAAACG-3′[4]，DHAR基因扩增引物序列为正向5′-CCACCTCATAAACTTGGCTGACA-3′，反向5′-TGTTTCTCTTCAGCGATGGTCTT-3′[1]，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系为40 μL，其中包括2×Mix 20 μL;ddH2O 16 μL;10 μmol/L的 Primer-F 及Primer-R各 1 μL;50 ng/μL的DNA模板2 μL。扩增程序为 94 ℃ 预变性4 min;然后进行35个循环，每个循环包括94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，观察拍照后送上海生工生物工程技术有限公司进行双向测序。将测序结果与GenBank中的序列利用BLAST工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，以确认扩增结果的正确性。

1.3 AsA含量测定

参照白静等的方法[14]，AsA含量采用高效液相色谱法测定。

1.4 数据分析

利用Lasergene 7.0软件对正反向序列进行拼接，参照Chromas序列峰图对误读点进行人工校正，并用软件Clustal X进行多序列对比[15]。利用DnaSP v5.1软件进行GGP和DHAR基因核酸多态性分析和单倍型分析[16]，以Network 5.0软件构建单倍型网络图;利用Structure 2.3.4软件计算其最佳群体值K=2，取此时的群体结构Q值作为协变量，以Tassel 2.1软件进行GGP和DHAR基因核酸多态性与果实维生素C含量的关联分析。

2 结果与分析

2.1 基因序列多态性分析

GGP基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为2 035 bp的同源序列，其中包含22处变异位点，11处为插入缺失标记（Insert/Delete，InDel）类型，11个为SNP类型;DHAR基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为 1 609 bp 的同源序列，其中包含69处变异位点，53处为InDel类型，16个为SNP类型（表2）。DHAR基因具有較高的DNA多态性，多态性核苷酸位点数量、核苷酸差异平均数（k）、核苷酸多样度（Pi）等参数分别为69、5.123 81和0.003 29。而GGP基因具有更高的单倍型多样性，单倍型数量（Ha）、单倍型多样度（Hd）等参数分别为15和0.900。

2.2 基因序列多态性及其与果实AsA含量的关联分析

对于GGP基因而言（表3），在0.01显著性水平上，所检测22处变异位点中，有3个SNP（267 T/A，305 T/G，420 G/T）与刺梨果实维生素C含量相关，解释率为0.319 1，在267 bp处为A碱基，305 bp 处为G碱基，420 bp处为T碱基是Hap15特有变异，它对应的材料ZY-29在所有材料中维生素C含量最高，为 2 590.47 mg/100 g，表明Hap15可能控制刺梨果实高维生素C含量。在0.05显著性水平上，有5处变异与刺梨果实维生素C含量相关，其中3处为InDel类型（639-/G，989-/T，1 215-/T），2处为SNP类型（1 354 C/G，1 355 T/C），在639 bp处为G碱基，1 354 bp 处为G碱基，1 355处为C碱基是Hap7的特有变异，它对应的材料LD-7中维生素C含量仅为987.59 mg/100 g，属偏低水平，表明Hap7可能控制刺梨果实低维生素C含量。

对于DHAR基因而言（表4），在0.05显著性水平上，所检测的69处变异位点中，有19处与刺梨果实维生素C含量相关，其中9处为InDel类型（399A/-，1 370-1 377 TCTGTAAG/—），10处为SNP类型（20 T/G，382 G/C，497 T/G，581 C/T，720 T/G，837 G/T，1 397 A/T，1 440 T/C，1 595 C/A，1 596 C/T，1 597 G/A）;在20 bp处为G碱基，382 bp 处为C碱基，399 bp处为缺失，497 bp处为G碱基，581 bp处为T碱基，720 bp处为G碱基，1 370～1 377 bp处插入TCTGTAAG，1 397 bp处为T碱基，1 595 bp处为A碱基，1 597 bp处为A碱基是单倍型Hap9的特有变异，它对应的材料为 LD-7、XY-24、BJ-3、AL-20，维生素C含量范围982.62～1 543.1 mg/100 g，平均值1 171.15 mg/100 g，属中偏低水平，表明单倍型Hap9控制中低水平的AsA含量;1 440 bp处为C碱基是单倍型Hap4～Hap6的共有变异，对应的材料ZY-29、MN-7、AL-17中AsA含量分别为2 590.47、1 652.57、1 668.35 mg/100 g，属中偏高水平，表明单倍型Hap4～Hap6可能控制中高水平AsA含量。

综合GGP基因和DHAR基因核苷酸多态性及单倍型结果来看（表3、表4），GGP基因特异单倍型Hap15和DHAR基因特异单倍型Hap4同时在高含量维生素C材料ZY-29中检测到，表明这2种单倍型共同存在于刺梨中时，可以使果实维生素C含量表现为高的状态;而GGP基因特异单倍型Hap7和DHAR基因单倍型Hap9同时存在于低含量维生素C材料 LD-7中，表明这2种单倍型共同存在于刺梨中时，可以使果实维生素C含量表现为低的状态。

2.3 单倍型间的进化分析

将所检测到的15条野生刺梨GGP基因和9条DHAR基因单倍型序列，通过Network软件构建了Median Joining网络聚类（图1、图2）。对于GGP基因而言，单倍型存在网状进化，Hap1位于网络图辐射化的中心，且包含了7个个体（表3），占试验材料的33.33%，分布最广，是主要单倍型，可推测该单倍型为原始单倍型或祖先单倍型，其余Hap2～Hap15均为特有单倍型，仅存在于1个个体中（表3），Hap2、Hap5、Hap7、Hap8、Hap10、Hap11、Hap14、Hap15位于发散网络图的末端，说明它们是较晚发生变异而产生的单倍型。对于DHAR基因而言，单倍型进化轨迹类似扇形，Hap1位于扇状图起始位点，包含8个个体（表4），占试验材料的38.10%，分布最广，是主要单倍型，可推测该单倍型为原始单倍型或祖先单倍型，Hap3、Hap8、Hap9为共享单倍型，Hap2、Hap4～Hap7为特有单倍型，仅存在于1个个体中（表4），Hap2、Hap6、Hap7、Hap9位于发散网络图的末端，说明它们是较晚发生变异而产生的单倍型。GGP基因和DHAR基因网络图中出现的mv均表明一些单倍型在进化过程中发生了丢失。

3 讨论

在21份刺梨野生种质中，ZY-29采于贵州省遵义市，位于最东端，在GGP基因和DHAR基因中呈现特异单倍型，分别为Hap15和Hap4;MN-7采于四川省冕宁县，位于最西端，在GGP基因和DHAR基因中也呈现特异单倍型，分别为Hap8和Hap5。对GGP基因而言，东西两端的试验材料ZY-29和MN-7对应的单倍型Hap15和Hap8在系统进化图上也位于相反的分枝上，表明GGP基因单倍型的进化可能与地理位置具有一定的相关性;而对DHAR基因而言，东西两端的试验材料ZY-29和MN-7对应的单倍型Hap4和Hap5在系统进化图上位于同一分枝，并进化出Hap6（图2），说明DHAR基因单倍型的进化可能不受地理条件的影响。

维生素C积累的遗传调控非常复杂，对维生素C代谢通路中的关键酶或限速步骤的研究即使在同一植物中也会存在差异[17-18]，在刺梨中也有相同的情况发生，从表观遗传学的角度，GGP和DHAR基因是争议的焦点[1，4]。本研究通过分析刺梨GGP和DHAR基因在不同种质中DNA序列的差异，从DNA水平研究2个基因与果实维生素C含量的关联性，在0.01水平上，仅GGP基因中的3个SNP显著地影响刺梨果实维生素C含量，但这3个位点均发生在内含子区域;在0.05水平上，则GGP和DHAR基因均存在与果实维生素C含量显著关联的变异位点，证明GGP和DHAR都是影响刺梨果实维生素C含量的关键基因，它们在DNA水平和表观遗传学方面都发挥了积极作用，在表观遗传学上，GGP基因是合成途径的关键基因，而DHAR基因是循环再生途径的关键基因。从DNA水平上来说，GGP基因具有更高的单倍型多样性，DHAR基因具有更高的DNA多态性。DHAR基因在21个材料中产生了69处变异位点，其中53处为InDel类型（表2），涉及2段ATGCTATTCAAATGAATGAAGT序列，但这2段变异并未与刺梨果实维生素C含量显著关联（表4），而当TCTGTAAG序列存在于DHAR基因时，刺梨果实可能维生素C含量较低。总之，刺梨果实维生素C含量可能由GGP和DHAR基因共同控制，当GGP基因特异单倍型Hap15和DHAR基因特异单倍型Hap4共同存在于刺梨中时，可以使果实维生素C含量表现为高的状态;而GGP基因特异单倍型Hap7和DHAR基因单倍型Hap9同时存在于刺梨中时，可以使果实维生素C含量表现为低的状态。

目前，刺梨在贵州的种植面积已达 13.33万hm2，并计划到2020年增加到 33.33万hm2，但真正用于栽培的仅贵农5号，随着刺梨高端产业的发展，市场需求更高AsA含量的品种，但以此为育种目标的品质改良尚未真正开展，因此，本研究将对培育我国专用刺梨品种、加快刺梨品质育种进程起到一定的推动作用。

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