数字PCR在食品安全检测中的应用研究进展

张宜文，赵海波,吴 红，马 康

(1.北京市计量检测科学研究院，北京 100021；2.中国计量科学研究院，北京 100013)

随着我国与世界各国食品领域贸易合作的不断深化，食品安全成为各国监管和市场竞争的关键。转基因生物的多样化带来了转基因基质的复杂性及其检测的挑战性[1]，全球农业种植中涉及30多种转基因农作物，其交易额逐年上升[2]。国际食品贸易中由于食品动植物源成分掺杂或失信导致的损失每年高达400亿美元[3-4]。全球范围内丰富的微生物种类(细菌、病毒、支原体等)及构型，以及感染宿主的多样化让检测变得复杂化，从而突显了非培养宿主式相对快速的检测方法的优势[5-6]。为降低生产、运输、销售、储存等各环节的食品安全风险和提高监管效率，食品监管部门对快速检测方面的需求增强，使得聚合酶链反应(PCR)技术在食品安全领域得到了广泛应用与发展。

食品自身种类的广泛性、差异性和基体复杂性促使其检测理论和方法不断改进和优化。目前食品检测领域的化学仪器技术包括色谱[7-8]、电化学[9]、光谱[10]、质谱[11]、核磁[12]以及多种串联技术[13]和生物传感器[14]等(图1)。这些方法广泛应用于食品检测的各个领域，在分离、鉴别、表征等方面有着显著优势，但存在前处理步骤多、复杂食品基体回收率低和设备昂贵等问题。食品检测的生物技术主要包括酶联免疫(ELISAs)、聚合酶链反应(PCR)等技术，其中ELISAs是最常见的食品分析方法，但其对于实验环境和样品状态的要求较高。PCR方法可以突破对实验环境以及食品基体的局限性，在转基因成分检测、动植物源掺杂、微生物检验方面可保持待测核酸分子的稳定性，识别特异性好，灵敏度高，已得到了广泛应用。图1中列出了食品分析技术的类别以及相关类别下的主流分析工具，图中虚线所包含区域内的仪器是相应分析对象的主要使用仪器。

图1 食品分析技术的类别、分析工具以及分析对象Fig.1 Main analytical categories,techniques and objects in food analysisPCR:qPCR(荧光PCR),dPCR(数字PCR),PCR-SSCP(单链构象多态性分析技术),LAMP(环介导等温扩增检测技术),HRM(高分辨熔解曲线分析技术);ELISA:ICGT(胶体金试纸条检测技术),RIA(放射免疫技术),FIA(荧光免疫技术),TRFIA(时间分辨荧光免疫分析),CLIA(化学发光免疫技术),SELEX(指数富集适配体系统进化技术) ;LC/GC(液相/气相色谱技术);LC/GC/ICP MS(液相/气相/电感耦合等离子体质谱联用技术);PTR-MS(质子转移质谱技术);TIMS(热电离质谱技术);DART-MS(实时直接分析质谱技术);IR(红外光谱分析技术);Raman(拉曼光谱分析技术);UV/FS(紫外可见/荧光光谱分析技术)；AAS(原子吸收分光光谱分析技术)；ICP(电感耦合等离子体光谱分析技术)；XRF(X射线荧光光谱分析技术);NMR(核磁波谱分析技术)

1 PCR原理

PCR技术通过对核酸分子进行变性、复性、延伸3个步骤的不断循环，使目标分子呈指数倍数的增长，从而使微量、痕量的核酸达到可检测水平。目前PCR技术主要可分为传统PCR(cPCR)、荧光PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)三代，并在此基础上建立了相关的食品检测方法，三代PCR的工作原理如图2所示。

图2 3种PCR的工作原理Fig.2 Work flow of three polymerase chain reactorsA.cPCR ；B.qPCR；C.dPCR

cPCR分析仪通过控制反应温度，使待测核酸分子在不同温度下变性、复性、延伸循环复制，再对经多次复制后的核酸分子进行凝胶分析，观察是否出现目标核酸的条带；qPCR是在cPCR基础之上，加入特定的荧光染料，其荧光强度与扩增后和染料结合的核酸分子的数量相关，通过终端PC可以实时显示扩增的状态。对比扩增后的荧光值与初始设定荧光强度，可得到待测核酸的阈值(Ct)，将Ct值代入到已知含量DNA的标准曲线，计算得到待测核酸的 DNA分子含量[15]；dPCR技术是将qPCR体系等量均分到相互隔离的大数量(多数大于10 000个)微小的反应单元(芯片微孔或微滴液珠)中，且理想状态下一个反应体系中至多包含一个待测核酸分子。dPCR的反应过程与qPCR相似，扩增后的核酸分子在荧光下显示荧光信号(表示为“1”)，或没有荧光信号(表示为“0”)，通过泊松分布对荧光信号“0”和“1”进行统计分析，即可实现对核酸含量的测定。dPCR不需要建立标准曲线，无需通过Ct值进行浓度比较，被认为是一种绝对定量的方法[16]。而且由于dPCR的反应效率和精密度受食品基质干扰的影响较小，理论上dPCR可以对所有可应用于qPCR的检测对象进行分析。

2 三代PCR相关标准进展

自2003年以来，我国食品监管相关部门分别针对动物源、植物源、微生物和转基因食品制定了相应的检测标准和方法。本文统计了2003年至2019年6月现行有效的PCR相关标准，并比较了cPCR、qPCR和dPCR相关标准在检测对象(表1)和实施年份、标准数量(图3)上的差异。

表1 食品中基于PCR分析的主要分析物比较Table 1 Comparison of major analytes in food based on PCR analysis

the relevant standards in this paper include the national,industrial and local standards related to PCR technology in food(本文涉及的“我国相关标准”均包括食品中PCR技术相关的国家标准、行业标准和地方标准);FAO( Food and Agriculture Organization of the United Nations,联合国粮食及农业组织粮农组织),FDA(Food and Drug Administration,食品药品监督管理局),WHO(World Health Organization,世界卫生组织)

图3 cPCR、qPCR和dPCR国内标准对比Fig.3 Comparison of domestic standards for cPCR,qPCR and dPCRA.classification by number of detection types in standard(标准中按检测类型数量分类),B.comparing cPCR,qPCR and dPCR to classify the number of detected objects(cPCR、qPCR、dPCR检测对象数量分类),C.standards of cPCR,qPCR and dPCR in different years(不同年度的cPCR、qPCR、dPCR标准情况),D.proportion of cPCR,qPCR and dPCR in total standard quantity(cPCR、qPCR、dPCR在总标准数量中的比例)

与国际标准相比，我国相关标准类别[17]种类匹配和分析物数量更为全面(表1)，FDA[18]和FAO/WHO[19]仅提供了较为有限数量的目标分析物。进一步对比这些分析物在检测方法上的差异，发现基于PCR方法的转基因和微生物是占比较大的两类(图3A)，目前的标准以cPCR和qPCR方法为主(图3D)，qPCR方法在动植物源的检测中占比最大，cPCR在转基因的定性筛选方面成本较低，标准数量较多(图3B);近年来基于dPCR技术的标准有所增加(图3C)，其在转基因、微生物和动植物源检测相关标准方面的数量分别为11种、8种、0种，而目前dPCR技术可为更多目标分析物的研究提供可靠性依据，为建立更多的dPCR检测方法提供了支持。

3 数字PCR(dPCR)在食品分析中的应用进展

近年来dPCR在转基因、动植物源和微生物检测方面的应用，以及dPCR和qPCR对不同分析物检测方法的比较研究成为热点。以下对dPCR在上述相关检测方面的研究进行了总结。

3.1 转基因检测

随着转基因技术的发展和转基因生物的普及，转基因生物面临着越来越多的食品安全相关的社会压力，制定合理的标准以及提供可靠的检测方法对规范转基因食品有着重要的意义。常见的转基因作物有抗除草剂类和抗虫类，具体见表2。

目前常用的转基因检测方法为传统PCR定性分析以及qPCR定量分析。qPCR和dPCR可用于转基因元件或品系的定量检测。qPCR结果受转基因核酸含量及基质影响偏大，而dPCR受此影响较小，因而更适合待测物中微量转基因的检测，且有较好的灵敏度和拷贝数分辨精度[20]。Kosir等采用多重dPCR转基因检测方法对同一样本中的内、外源基因进行同时检测，避免了多次取样的误差，并且使得操作更加简单，大大缩短了检测时间[21]。

表2 数字PCR转基因检测方法及使用材料Table 2 Digital PCR detection of transgenic genes and material used

(续表2)

*ddPCR:droplet digial PCR(微滴数字PCR)；cdPCR：camber digital PCR(微孔数字PCR)

3.2 动物源掺杂

动物源和植物源的掺杂检测是基于DNA检测的另一重要应用方向。肉制品生产环节中有意或无意掺杂未标明的肉类成分已成为全球面临的食品安全热点问题。在动物源掺杂的报道[50]中，不仅存在在高价格的肉制品(如猪肉、牛肉、羊肉)中掺杂廉价肉制品(如鸡肉、鸭肉等)的情况，更有直接加入一定比例的低价肉制品的现象。这些未标明的肉制品成分不仅损害了消费者的利益，而且带来食品安全隐患。

数字PCR可为动物源成分的精确定量及准确区分掺杂提供解决途径。其定量方式可分为两种：一种方法是通过数字PCR测定动物源成分的准确拷贝数，计算得到拷贝数与样本质量的比例数(用%表示)。然后通过与目标动物源成分的标准比例数比较，判断待测样品中所含目标动物源成分的掺杂情况。这种方法需要建立庞大的拷贝数/质量标准库，且不同种类的肉制品拷贝数与质量的比例数差异较大；另一种方法是直接用拷贝数比例数据作为判别掺杂的依据，即从不同种类动植物组织或含有动植物的食品中提取核酸后，测算单位质量各个种类的目标基因拷贝数比值，建立基因拷贝数与质量之间的关系，利用该比例关系(转换因子)换算出可能的不同种类物质添加量，从而实现动植物源性成分的定量检测。

Qiang等[47]对5种不同种类的山羊和绵羊肉类中24种肉制品掺杂进行分析，检测限达1copy/μL(山羊)和5copies/μL(绵羊)，且在多种肉类掺杂中特异性表现良好。任君安[48]采用四重、五重数字PCR分析羊肉中的4种掺杂肉类成分，并发现反应进行程度受温度、压力等环境影响较小，数字PCR方法的线性范围宽(掺杂率1%～90%)，相对标准偏差小于25%。

Koppel等[49]通过将肉制样品和与其相似的参考物质用转换因子联系起来，将数字PCR得到的拷贝数通过转换因子转换成质量百分比，对猪肉和牛肉的掺杂进行了分析。在随后的工作中，Koppel等基于微滴数字PCR技术同时检测了牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡、绵羊和马肉6种肉制品在煮熟香肠基质中的比例，使用6家实验室的环形比对得到的每种肉制品的平均转换因子进行转换后，取得待测香肠肉制品中添加的6种肉的比例估计。与实时PCR结果相比(不确定度30%)，数字PCR具有较高的准确性(不确定度10%)[50]。

王强等[51]对9种鹅肉及其他21种添加肉制品进行了检测，通过将实测数字PCR拷贝数代入样品质量与靶基因拷贝数，得到方法检出限为LOD95%为1 copy/μL。Noh等[52]将微滴数字PCR用于混合鱼酱产品中阿拉斯加狭鳕鱼(Gadus chalcogrammus)的定量分析，混合样品重量与DNA浓度的关系无显著性差异，实验偏差较低。上述研究表明ddPCR在混合样品的检测中具有较好的准确性。

3.3 植物源掺杂

与动物源相类似，植物源食品也存在成分掺杂的情况。杨硕等[53-54]从植物组织或植物蛋白饮料中提取核酸后，进一步对比了椰子汁中的大豆和花生成分，并使用荧光实时PCR和数字PCR同时对6组样品进行测定，结果表明数字PCR结果具有较好的准确性，可以减少假阳性几率。刘二龙等[55]对红薯中的紫薯、木薯、马铃薯、藕、芋头、豌豆、高粱、胡罗卜、番茄、大米、大豆和大麦作物等12种掺杂成分进行了测定，可对质量百分比为5%以上的红薯成分进行定量测定，精密度(RSD)≤25%，检出限(LOD)为2.53 copies/μL。

3.4 微生物检测

病原微生物是食品安全检测中常见的致病因素，包括细菌、病毒和支原体等。传统分析方法有基体培养镜检、免疫方法和分子方法。与这些方法相比，数字PCR分析时间更短且不因基质中组成成分产生抑制反应，检测灵敏度高。目前已有报道使用数字PCR技术对沙门杆菌[56-57]、金黄色葡萄球菌[58]、李斯特氏菌[59]、副溶血性弧菌[60]、猪圆环病毒[61-62]等常见微生物进行了方法学验证，并制定了相关的数字PCR方法行业检测标准。董莲华等[63]建立了大肠杆菌E.coliO157:H基因组DNA微滴数字PCR检测体系，对5株非大肠杆菌和5株大肠杆菌O517:H7血清型的菌株基因组DNA 进行了方法特异性验证，并对猪肉、牛肉、鸡肉等13份市售肉制品进行E.coliO157:H检测，测得结果与荧光PCR方法一致。方佩佩等[64]以不耐热溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)为靶基因建立了17种混合菌种微滴数字PCR技术方法，测定了鳕鱼中的副溶血性弧菌含量，方法特异性良好，检测时间由稀释培养计数(Most probable number,MPN)定量方法的3～5 d缩短至3～5 h。

Nshimyimana[65]及Staley[66]等使用微滴数字PCR对微生物来源进行测定，结果表明数字PCR具有更好的特异性及灵敏度，是一种合适的测定微生物来源的方法。Palumbo等[67]在葡萄和葡萄干的生产过程中利用几种真菌毒素的钙调蛋白基因序列差异，使用数字PCR技术对赭曲霉毒素A进行监测，所得葡萄不同生长时期、不同葡萄种植园的数字PCR监测数据可提供该地区的实时情况，并预测后期的生长、丰收情况。

Liu等[68]证明荧光PCR和数字PCR在柑橘黄脉清除病毒(CYVCV)的检测中均具有较好的线性，但数字PCR具有更好的灵敏度，是荧光PCR的100倍。Jahne等[69]利用荧光PCR和微滴数字PCR测定了中水和废水中的诺如病毒和腺病毒，结果显示微滴数字PCR的灵敏度(中水中GⅡ型诺如病毒检测灵敏度4%，腺病毒检测灵敏度 14%)高于荧光PCR，与前期相关文献报道一致[70]。Morella等[71]在对病毒(噬菌体)的研究中，认为微滴数字PCR是一种更快速、低消耗、高通量的检测方法，建议广泛应用在噬菌体的检测中。

Maheshwari等[72]使用数字PCR和荧光PCR方法对柑橘类中支原体柠檬螺旋体的SP1和ORF1基因进行检测，发现对于SP1，数字PCR的检测灵敏度(0.000 01 ng)高于荧光PCR(0.000 1 ng)，两种方法检测ORF1的灵敏度相同。Bahder等[73]对棕榈树中的16SrIV-A和16SrIV-D 型植原体进行数字PCR(TaqMan)检测，同时与荧光PCR和巢式PCR(nested PCR，nPCR)进行对比。结果表明，数字PCR拥有更低的检出限，在0.000 1%原始提取液稀释液中检出目标物，而荧光PCR在0.1%原始提取液稀释液中检出，巢式PCR在0.01%原始提取液稀释液中检出(同位素稀释方法定量)。

4 结论与展望

文献整理和分析表明，数字PCR技术适用于转基因、动植物源和微生物的检测，具有较高灵敏度，但对于不同分析物，数字PCR与荧光PCR技术的应用评价不同，其中数字PCR在转基因、动物源、部分植物源和微生物的文献报道中具有更高灵敏度以及对抑制成分的抗干扰能力[74]。

但数字PCR技术的应用受到方法稳定性、仪器操作等多因素的制约，杨冬燕等[75]的研究表明，在厨房废弃油脂的实验中，数字PCR在灵敏度和准确率方面具有优势，但其方法稳定性和精密度不及荧光PCR，导致应用优势不明显。因此，与技术和产业都相对成熟的荧光PCR技术相比，数字PCR技术仍然有探索和改进的空间。此外，准确定量检测需要多种标准物质的支持[76]，而目前国内转基因的标准物质较少，无论是研究还是检测，都需要购买大量国外商用转基因标准物质，如欧洲标准物质中心(ERM)、欧盟标准局(IRMM)、美国油脂化学协会(AOCS)、日本厂商以及一些国外试剂公司的标准品，导致数字PCR技术使用成本昂贵，不利于技术的完善与应用。

无需依赖标准曲线绝对定量，以及对低含量核酸样品检测的高准确度使数字PCR技术在食品安全检测领域具有十分广阔的应用前景。目前制约其发展的因素主要为标准品价格昂贵和缺少标准方法。由于数字PCR方法与多数荧光定量PCR方法具有兼容性，使得可用于数字PCR的目标分析物和适用方法不断积累，并应用于更广泛的领域。数字PCR可与化学分析方法相互辅助得到趋于完整的信息。未来将有更多的实验室将数字PCR方法纳入ISO 17025，数字PCR将应用到越来越多的食品安全检测中并发挥更加重要的作用。