基于共价有机骨架修饰电极的苯并芘电化学发光传感器

2020-06-01徐文清庞月红

分析测试学报 2020年5期

孙苗，徐文清，王黎，庞月红

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

多环芳烃(PAHs)是一类由两个及以上苯环稠合而成的持久性有机污染物，极易在食品加工过程(如烧烤、烘烤、熏烤、煎炸等)中产生[1-2]，对人体有非常强的致癌、致畸和致突变毒性[3-4]。苯并芘(BaP)是PAHs中致癌性最强的一种，是世界卫生组织认证的三大致癌物之一[5-7]，常作为PAHs的指标化合物。因此，对食品中BaP含量的测定具有非常重要的意义。

目前，食品中BaP的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[8-10]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[7,11]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[12-14]、酶联免疫吸附法(ELISA)[15-16]、荧光分析法和电化学方法[5,17]等。其中电化学发光法(ECL)作为一种新型的电化学及发光分析方法，由于具有仪器设备成本低、操作简单、快速、灵敏度较高等特点而被广泛应用于食品及环境监测等领域[18-20]。

共价有机骨架(COFs)是一类由轻元素(如H、B、C、N和O等)通过强共价键连接的结构高度有序的新型晶型多孔材料，与其他材料相比，具有孔径可调、孔隙率持久、热及化学稳定性较高、比表面积较大、可功能化等特点，而被广泛应用于气体储存、催化、样品前处理、色谱分析等领域[21-22]。近年来，已有将COFs材料应用于电化学及传感方面的研究报道，如孙淑敏等[23]合成三嗪基共价有机骨架/石墨烯复合材料，并研究其用作超级电容器电极材料的电化学性能；Banerjee 课题组[24]通过信号开、关两种传感机制将2D COF 纳米片用于硝基芳香化合物的快速、高灵敏检测；Zhang等[25]通过将制备的TAPB-DMTP-COFs复合材料与金纳米结合构成了一种检测绿原酸的电化学传感器。CTpPa-2是由功能化的1,3,5-三醛基间苯三酚(CTp)与2,5-二甲基对苯二胺(Pa-2)通过缩合反应形成的一种亚胺类COF材料[26-27]，具有较好的结晶度、较大的比表面积、良好的稳定性，并含有丰富的共轭结构，其孔径约为12 Å，略大于BaP的分子直径(11.5 Å)。本文通过滴涂法将功能化的共价有机骨架材料CTpPa-2修饰至电极表面，建立了一种新型的基于共价有机骨架的BaP电化学发光传感器，并将其用于烤肉样品的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MPI-E型电化学发光分析系统包括电化学分析仪和多功能化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)；CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；FE20K精密pH计(Mettler-Toledo Instr Ltd)；Milli-Q Integral Cabinet 3超纯水系统(美国密里博公司)。

鲁米诺(BBI生命科学有限公司);苯并芘(上海百灵威科技有限公司);过氧化氢、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、四氢呋喃、无水乙醇、氢氧化钠、硝酸(国药集团化学试剂有限公司);所有试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 CTpPa-2修饰电极的制备玻碳电极(GCE)的预处理：依次采用3 μm和0.05 μm Al2O3粉末对裸玻碳电极研磨抛光至镜面，然后在硝酸水溶液(1∶3,体积比)、乙醇和水中各超声30 s、1 min、1 min，氮气吹干后，采用循环伏安法(CV)以0.03 V/s的扫速在10 mL 1 mmol/L铁氰化钾的电解液中进行扫描，当扫描的氧化峰和还原峰峰电位差(ΔEp)间隔小于0.1 V时，表明电极洁净度较好。再经水冲洗，氮气吹干备用。

CTpPa-2/GCE制备：将5.0 mg共价有机骨架材料CTpPa-2溶于5.0 mL乙醇溶液，超声振荡2 h后，与1%Nafion的乙醇溶液以1∶1体积比进行混合并超声至分散均匀。取5.0 μL混合溶液均匀滴于经预处理的电极上，待电极表面晾干，标记为CTpPa-2/GCE。

1.2.2 电化学测试及电化学发光检测采用三电极体系，以CTpPa-2/GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，在1 mmol/L铁氰化钾电解液中以0.03 V/s的扫速进行CV扫描，测试修饰电极的电化学性能。以含20 nmol/L的鲁米诺，pH为8.5的磷酸缓冲液(PBS)(2 mL磷酸缓冲溶液、20 μL过氧化氢溶液、20 μL鲁米诺)为电解液，对CTpPa-2/GCE进行差分脉冲法扫描。

在电化学发光检测过程中，以CTpPa-2/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，并以上述PBS溶液为电解液。设置循环伏安参数为：初始电位0 V，高电位0.8 V，低电位0 V，扫速100 mV/s，光电倍增管为800 V。体系置于暗箱中进行电化学发光反应，同时记录其循环伏安特性和电化学发光强度。于鲁米诺的反应电位处观察峰形，测试鲁米诺的电化学发光响应程度。

1.2.3 样品处理烤肉样品购自当地烧烤摊，均质后，准确称取30 g，于90 mL乙腈-水(9∶1，体积比)混合溶液中依次超声、100 ℃水浴提取1 h，待冷却浸泡1夜后，离心过滤，收集上清液，经滤膜过滤后备用。样品溶液经0.1 mol/L氢氧化钠调至pH 8.5后代替上述电解液中的磷酸缓冲溶液进行电化学发光测定。

1.2.4 高效液相色谱法测定参照国家标准GB 5009.27-2016[28]，采用高效液相色谱法对实际样品中的BaP进行检测。色谱条件为：C18色谱柱，流动相为88%的乙腈水溶液，流速1.0 mL/min，激发波长384 nm，发射波长406 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL。

2 结果与讨论

2.1 BaP电化学发光传感器构建

BaP电化学发光传感器的构建如图1所示，通过简单的滴涂方式将共价有机骨架材料CTpPa-2修饰至洁净电极表面，然后在鲁米诺-过氧化氢为电解液的三电极体系中分别考察裸GCE及CTpPa-2/GCE对鲁米诺电化学发光的响应情况。由差分脉冲曲线(图2A)可以看出，裸GCE在约0.5 V电位处的氧化峰电流为1.18 μA，而CTpPa-2/GCE的电流值为1.57 μA，说明CTpPa-2材料的引入能够增强电极上鲁米诺的氧化还原反应，起到放大电流信号的作用。电化学发光实验也表明，同样在0.5 V电位处，裸GCE的电化学发光强度约为1 900 a.u，而CTpPa-2/GCE约为7 780 a.u(见图2B)，表明经CTpPa-2修饰后电极上鲁米诺的发光强度增强近4倍。这可能是由于CTpPa-2的存在不仅增大了电极的比表面积，使鲁米诺与电极的接触面积变大，且CTpPa-2本身所富含的共轭体系与鲁米诺的苯环结构间产生了π-π相互作用，使鲁米诺在CTpPa-2/GCE上发生了聚集，双重作用下，导致鲁米诺的电化学发光信号得到极大增强。

图1 CTpPa-2/GCE的制备过程及检测示意图Fig.1 Schematic diagram for preparation process and detection of CTpPa-2/GCE

图2 GCE、CTpPa-2/GCE在鲁米诺体系中的差分脉冲曲线(A)和ECL响应曲线(B)Fig.2 Differential pulse curves(A) and ECL responses(B) of bare GCE and CTpPa-2/GCE in luminol systema:bare GCE ;b:CTpPa-2/GCE

图3 600 nmol/L BaP对CTpPa-2/GCE在鲁米诺体系中ECL强度的影响Fig.3 Effect of 600 nmol/L BaP on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system

从图3可以看到，当向反应体系中加入BaP后，CTpPa-2/GCE电极上的电化学发光强度大幅度减弱，这可能是由于BaP相较于鲁米诺含有更多的苯环，更易与电极表面的CTpPa-2材料结合，与鲁米诺间产生了竞争作用，导致鲁米诺的吸附量减少，从而造成电化学发光信号的降低。本文根据BaP的加入量与信号减弱程度的关系，构建了BaP的电化学发光传感器。

2.2 CTpPa-2/GCE的表征

图4为CTpPa-2/GCE在缓冲溶液中的恒流充放电曲线(A)及循环伏安曲线(B)，由图4A可看到，CTpPa-2能够较快进行完全的充放电，而由图4B可观察到，在-0.1 V左右有1个还原峰，但并无氧化峰出现，表明反应过程不可逆。上述电化学测试均表明该材料具有良好的电化学性能。

采用扫描电子显微镜(SEM)和循环伏安法对CTpPa-2/GCE进行表征(图5)。由SEM图可以看出，裸GCE的表面光滑平整(图5A-a)，而经CTpPa-2材料修饰后，电极表面变得粗糙，且呈现褶皱的形态，从而提供了较大的比表面积(图5A-b)，表明CTpPa-2已成功修饰至电极表面。

图4 CTpPa-2/GCE在0.32 A/g电流密度下的恒流充放电曲线(A)，以及GCE与CTpPa-2/GCE的循环伏安曲线(B)Fig.4 Galvanostatic charge/discharge curve of CTpPa-2/GCE at a current density of 0.32 A/g (A),and CV curves of bare GCE and CTpPa-2/GCE (B)a:bare GCE;b:CTpPa-2/GCE

分别将裸GCE及CTpPa-2/GCE浸入1 mmol/L铁氰化钾溶液中，扫描其循环伏安图(图5B)。可观察到，相较于裸GCE，CTpPa-2/GCE的氧化、还原峰电流值分别由-13.17 μA和12.95 μA上升至-14.58 μA和15.52 μA，表明经过CTpPa-2修饰后电极的电化学性能较裸GCE更佳。

图5 裸GCE 及CTpPa-2/GCE表面的SEM图(A)，以及GCE和CTpPa-2/GCE在1 mmol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线(B)Fig.5 SEM images(A) and CV curves in 1 mmol/L potassium ferricyanide solution(B) of bare GCE and CTpPa-2/GCEa:bare GCE;b:CTpPa-2/GCE

图6 pH值对CTpPa-2/GCE在鲁米诺体系中 ECL强度的影响Fig.6 Effect of pH value on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system

2.3 电化学发光检测条件的优化

为使CTpPa-2/GCE在鲁米诺体系中获得更强的电化学发光信号，以实现对BaP更灵敏的检测，本实验分别对电解液pH值及扫描速率进行了优化。

图7 不同浓度BaP对CTpPa-2/GCE在鲁米诺体系中ECL强度的影响Fig.7 Effect of different BaP concentrations on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system BaP concentration (a-g):0,50,200,300,400,500,600 nmol/L;insert:linear relationship between ECL intensity and BaP concentration

2.3.1 pH值对电化学发光强度的影响大量研究表明，鲁米诺在中性和碱性体系中才具有良好的电化学发光性能。因此本实验在pH依次为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的电解液中考察了CTpPa-2/GCE在鲁米诺体系中的电化学发光强度。由图6可以看出，在pH 7.0～8.5范围内，电化学发光强度逐渐增强。此后，随着pH值的进一步增大，发光强度呈下降趋势。因此，本实验选择鲁米诺体系的最佳pH值为8.5。

2.3.2 扫描速率对电化学发光强度的影响电化学发光的发光效率与激发态物质的产生和湮没比率有关，而激发态物质发生电化学反应的效果与扫描速率的快慢有关，过慢或过快的扫描速率均会导致发光强度的降低。因此本实验在扫描速率为0.05～0.12 V/s范围内对电化学发光强度进行考察。结果显示，随着扫描速率的不断增加，电化学发光强度逐渐增大并在0.10 V/s处达到最大值，随着扫描速率的继续增加，电化学发光强度逐渐减弱。因此，本实验选择0.10 V/s作为后续实验的扫描速率。

2.4 BaP的电化学发光检测

在最优实验条件下，向含鲁米诺的PBS溶液中加入不同浓度的BaP，依次测定其电化学发光强度(图7)。结果显示，随着BaP浓度的增加，电化学发光强度逐渐降低，且发光强度与加入的BaP浓度在50～600 nmol/L范围内呈良好的线性关系(r2= 0.995 1)，检出限(S/N=3)为5.60 nmol/L。

2.5 电化学发光传感器的稳定性与抗干扰性

发光体系和修饰电极的稳定性有助于构建性能优异的电化学发光传感器，因此本实验考察了该电化学发光传感器的稳定性。将所制备的CTpPa-2/GCE在含鲁米诺的PBS溶液中连续扫描10圈后，电化学发光强度值为初始响应值的99.7%。将修饰后的电极于室温干燥环境中放置7 d后，考察电极放置前后对BaP响应值的变化。结果显示，放置后的响应值为初始响应值的91.5%。实验结果表明本文制备的CTpPa-2/GCE具有很好的稳定性。

要实现食品中BaP的检测，需排除能与BaP共存且性质相似物质(如脂溶性抗氧化剂)的干扰，为此，进一步考察了电极的抗干扰性。食品中常见的该类似物质有没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、维生素E等。本实验分别将0.1 mol/L的PG、TBHQ及维生素E与BaP一同放入电解液中进行电化学发光检测，实验结果显示BaP的相对电化学发光强度值分别变化了2.4%、3.9%和5.0%。说明上述抗氧化剂未对BaP的电化学发光检测产生明显干扰，本文制备的电化学发光传感器具有较好的抗干扰性。