高效液相色谱法测定土壤中6种邻苯二甲酸酯的含量及其生物有效性的评价

2020-06-01刘成霞刘绿叶

理化检验-化学分册 2020年2期

刘成霞，朱洋，刘绿叶

(上海实朴检测技术服务有限公司，上海200100)

邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类常用的塑化剂，可增加塑料的柔韧性和强度，因此广泛应用于食品包装、儿童玩具、化妆品、纺织品和生物医学设备等软质塑料中[1-3]。PAEs可通过多种途径污染环境，如大气、饮用水、土壤、食品包装材料等，土壤中的塑化剂主要来源于农膜及其他废弃塑料制品的携入。PAEs及其代谢产物和降解产物对人体健康的危害很大，不但会损伤人体肝脏、肾脏、生殖器官，还会干扰人体正常内分泌，影响体内荷尔蒙含量，长期在体内积累还可能会导致畸形、癌变和细胞突变[4-6]。美国环保署将6 种PAEs列为优先控制的重点污染物，包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁基苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二辛酯(DNOP)。塑化剂的测定主要集中在塑料容器以及塑料包装材料中，但近年来，一些不法商贩利用塑化剂的增塑特点将塑化剂代替起云剂和乳化剂加入到食品，甚至药品中[7]。对土壤中塑化剂的测定及其生物有效性的同步研究较少。

土壤中的PAEs能够被植物和无脊椎动物吸收，并通过食物链在动物和人体内累积，食物中的污染物从食品基质中释放后进入消化液，由上皮细胞转入静脉，继而转移到靶器官发挥毒性作用[8]。体外胃肠模拟法可以利用人工配制的消化液，模拟人体的胃和肠的消化过程来分析污染物的生物有效性[9-11]。通常只有部分有机污染物溶解在胃肠液中，这部分被认为是可能被人体吸收，即生物有效态的部分[12]。测定土壤中有机污染物的生物有效性对评价其暴露风险至关重要[13]。本工作以体外胃肠模拟法为基础，分析土壤中PAEs的生物有效性，为评价其健康风险和污染管控提供依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000型高效液相色谱仪，配可变波长紫外检测器；梅特勒S220型p H 计；0.45μm 有机过滤膜。

6种PAEs混合标准储备溶液:100 mg·L－1。

胃液:称取1.25 g胃蛋白酶，0.50 g苹果酸钠，0.50 g柠檬酸钠，加入420μL 乳酸和500μL 乙酸溶解后，用乙酸定容至1.000 L，并用50%(体积分数)盐酸溶液调节p H 至2.5[14]。

甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

Zorbax Eclipse C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)，柱温40 ℃；进样体积20μL；流量1 m L·min－1；测定波长245 nm。流动相:A 为乙腈，B 为水。梯度洗脱程序:0～5 min 时，A 为70%；6～10 min时，A 由70%升至95%，保持10 min。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

分别称取10.000 g土壤样品于2个50 m L 玻璃瓶中，第一份样品中加入10 m L 胃液，在37 ℃下，以100 r·min－1转速振荡提取1 h，模拟胃液的消化过程。胃液提取结束后，用碳酸氢钠(粉末)调节消化液p H 至7.0，加入55.0 mg胆汁盐和15 mg胰液素即得肠液，然后在37 ℃下，以100 r·min－1转速继续振荡2 h，完成肠液的提取。提取结束后，以4 000 r·min－1转速离心3 min，取上清液加入10 m L甲醇，超声提取30 min。按同样方法操作进行空白试验。另一份样品中加入10 m L甲醇，超声提取30 min，按同样方法操作进行空白试验。反应结束后向两份提取液中加入足量硫酸镁和氯化钠，以4 000 r·min－1转速离心3 min，取上清液定容至10.0 m L，经0.45μm 有机滤膜过滤后按色谱条件进行测定。

1.3.2 生物有效性计算

污染物的生物有效性的计算见公式(1):

式中:xB为污染物的生物有效性；ρ1为污染物从基质中释放到胃肠模拟液中的质量浓度，mg·L－1；ρ2为基质中污染物的总质量浓度，mg·L－1。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件对10.0 mg·L－1的6种PAEs混合标准溶液进行测定，色谱图见图1。

图1 6种PAEs混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 6 PAEs

2.2 色谱条件的选择

试验以乙腈-水二元溶剂体系为流动相，采用了Zorbax Eclipse C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)分离，经过反复试验，摸索出有效分离6种PAEs的梯度洗脱程序，并考察了不同流量对分离6种PAEs的影响。初始，乙腈与水的比例为70∶30，以5 m L·min－1速率将乙腈的比例升至95%；因DMP和DEP 的保留时间较接近，控制流量为1 m L·min－1，在10 min 内可有效分离DMP、DEP、BBP；在10～20 min 时，保持乙腈的比例为95%，DBP 和DEHP 的保留时间相差较大，可在20 min内分离6种PAEs。选择合适的梯度洗脱程序，可有效降低基线漂移对6种PAEs的影响，获得较好的分离效果。试验选择的流量和梯度洗脱程序见1.2节。

2.3 标准曲线和检出限

移取适量的100 mg·L－16种PAEs混合标准储备溶液，用乙腈稀释成0.10，0.50，1.00，2.50，5.00，10.0 mg·L－1的6种PAEs混合标准溶液系列，按色谱条件进行测定，以6种PAEs的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线。结果表明:6种PAEs的质量浓度均在0.10～10.0 mg·L－1内与其对应的色谱峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表1。

按色谱条件对2.50 mg·L－1的6种PAEs混合标准溶液进行测定，计算7次平行测定的标准偏差，按照公式(2)计算方法的检出限:

式中:XMDL为方法检出限；n 为样品的平行测定次数；t 为自由度为n－1，置信度为99%时的t 分布(单侧)；s 为n 次平行测定的标准偏差。当n＝7，置信度为99%时，t＝3.143。方法的检出限结果见表1。

表1 线性回归方程、相关系数和检出限Tab.1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.4 精密度和回收试验

按试验方法对土壤标准样品(HTSB-4)、地表土壤样品、农田土壤样品进行分析，均未检出6 种PAEs。对上述土壤样品进行加标回收试验，平行测定7 次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝7)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝7)

由表2可知:回收率为95.6%～96.4%，RSD 为0.22%～0.56%。

2.5 土壤中PAEs的生物有效性

对土壤标准样品(HTSB-4)加标(加标量为1.00 mg·L－1)，其生物有效性结果见表3。

由表3可知:不同PAEs的生物有效性存在一定差别。PAEs脂溶性越高，其生物有效性越低。其主要原因为目前体外胃肠模拟法是基于污染物在介质和消化液中的平衡分配原理进行的，污染物的生物有效性与其辛醇-水分配系数有关。在体外胃肠模拟试验中，没有足够的亲脂性物质提供吸附力使得亲脂性有机污染物由固体颗粒释放到胃肠模拟液中，从而降低了它的转化。

表3 土壤中6种PAEs的生物有效性Tab.3 Biological availability of 6 PAEs in soil

2.6 土壤理化参数对PAEs生物有效性的影响

影响污染物对土壤生物毒性的因素主要包括:矿物质种类(影响化合物吸附)、粒径分布(影响表而积)、水含量(影响化合物分配和可利用性)、渗透度(影响传输能力)、结构(影响孔隙率)、酸度、温度、金属含量、含碳有机质(TOC)、孔隙率(影响渗透性)、密度(决定孔体积，受土壤中矿物质含量和种类、有机质、土壤结构影响)、无机离子、污染历史等[15]。试验对某地土壤进行了研究，分析方法参照《全国土壤污染状况详查土壤样品分析测试方法技术规定》第三部分《土壤理化性质分析测试方法》。结果表明:某地土壤样品中DEHP 检出率较高，主要原因在于DEHP是应用最为广泛的增塑剂，其辛醇-水分配系数较高，不易降解，易被土壤吸附，同时其生物有效性较低，造成持久性污染。土壤理化性质与生物有效性的相关性见表4。

由表4可知:待测土壤样品生物有效性与含水率、湿密度成反比，与TOC 有一定的相关性，这与文献[16]研究结果一致。

本工作采用高效液相色谱法测定土壤中6 种PAEs的含量，方法精密度高、准确可靠。同时以体外胃肠模拟法分析土壤中PAEs的生物有效性。人体胃肠道具有复杂的生理结构，当食物等介质进入以后，污染物不断从介质上解吸附下来，然后被胃肠道吸收。但在静态的体外胃肠模拟试验中，达到消化平衡后，并没有存在像活体一样的吸收过程，这会限制污染物从介质上的解吸附。因此，这种基于平衡分配原理的静态体外模拟试验测得的生物有效性可能会低于活体试验测得的生物有效性。本工作为PAEs体内代谢提供前期参考，在后续的研究中建议采用液相色谱-质谱法或同位素示踪法对体内代谢物进行分析，并结合毒性因子，完善评价土壤中PAEs生物有效性的方法。