超高效液相色谱法测定儿童指画印泥中柚皮苷和苯甲酸地那铵

望秀丽，卫碧文，高 欢，于文佳

(上海海关机电产品检测技术中心，上海200135)

苦味剂又称厌恶剂、阻食剂，是一种添加于产品中，使其味道或气味带有苦味以防止人们尤其是儿童吸入或摄入的有毒有害物质，以及防止啮齿类和鸟类破坏设施而广泛使用的化学制剂[1]。苯甲酸地那铵，也称苦精，其结构由苯甲酸基团和地那铵基团组成，是目前已知的最苦的化合物，是苦味剂的典型代表。苯甲酸地那铵具有化学性质稳定、价格低廉、易于获得、极易溶于水等特点。苯甲酸地那铵的哺乳动物半数致死量为841 mg·kg－1(体重)，仅需极少量(0.000 01%)添加即可起到阻食效果[2]，其在通常使用条件下安全无毒，是日常消费品中常用的苦味剂，例如为防止儿童摄入有毒但带有甜的防冻剂，可在其中加入苯甲酸地那铵。柚皮苷是从西柚皮中分离的一种双氢黄酮类化合物，有苦味。柚皮苷作为苦味剂，具有可以食用、安全无毒、来源广泛等优点。为了尽可能降低幼儿潜在的有意或无意将指画颜料放入口中的风险，世界多标准均要求指画颜料中应添加的苦味剂为柚皮苷和苯甲酸地那铵。欧盟标准EN 71-7:2014＋A2:2018、国际标准ISO 8124-7:2015 和国家指画颜料产品标准 GB 6675.14－2014 对苦味剂的要求是一致的。上述标准给出了参考添加质量分数为:1%柚皮苷、0.000 4%(4 mg·kg－1)苯甲酸地那铵。

目前，国内外标准和文献报道的苯甲酸地那铵的仪器分析方法主要为高效液相色谱法[3-5]，柚皮苷的仪器分析方法主要为高效液相色谱法[6]和高效液相色谱-质谱法[7-9]。国内和国际上有关消费品中的涉及柚皮苷和苯甲酸地那铵的测定标准包括ASTM D7304－2014和EN 1214:1997。国内外涉及苯甲酸地那铵的测定方法的文献数量较少，文献[3]报道了高效液相色谱法测定俄勒冈消费品中苯甲酸地那铵的方法，将样品用甲醇稀释，离心，过滤后，采用高效液相色谱法测定，测定下限为1.25 mg·L－1。国内外涉及柚皮苷的测定方法的文献主要集中在中药方面[6-7，9]，国内文献报道了高效液相色谱法测定复方当归胶囊、通宣理肺颗粒、衢枳壳和去滞散中柚皮苷的方法。文献[7]报道了高效液相色谱法(二极管阵列检测器)和高效液相色谱-质谱法同时测定参术健脾汤中14种生物活性化合物的方法。

儿童指画印泥为指画颜料的一种，儿童用手指在儿童指画印泥上蘸取颜料进行创作，儿童意识薄弱，若儿童指画印泥产品无添加苦味剂或添加量不符合标准要求，儿童易通过舔食对其身心健康造成严重危害。超高效液相色谱法具有分析速率快、分离效率高等优点[10-11]，目前，尚未见超高效液相色谱法测定儿童指画印泥中柚皮苷和苯甲酸地那铵的报道。本工作采用超高效液相色谱法测定儿童指画印泥中柚皮苷和苯甲酸地那铵的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC 型超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；eppendorf 5810 R 型离心机；Elma P180H 型超声仪；0.22μm 有机系过滤膜。

柚皮苷标准储备溶液:1.00 g·L－1，称取100 mg柚皮苷标准品，用适量甲醇溶解后，用甲醇定容至100.0 m L。

苯甲酸地那铵标准储备溶液:1.00 g·L－1，称取100 mg苯甲酸地那铵标准品，用适量水溶解后，用水定容至100.0 m L。

甲醇、乙腈均为色谱纯；柚皮苷的纯度不小于97%，苯甲酸地那铵的纯度不小于95%；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)，柱温40 ℃；流量0.3 m L·min－1；进样量10μL。流动相:A 为乙腈，B为p H 4.3的0.02 mol·L－1磷酸二氢钾溶液。梯度洗脱程序:0～2.0 min 时，A 由10%升至30%，保持3.0 min；5.0～5.1 min时，A 由30%降至10%，保持1.9 min。柚皮苷测定波长为282 nm，苯甲酸离子测定波长为230 nm，地那铵离子测定波长为210 nm。

1.3 试验方法

称取约0.2 g儿童指画印泥样品于具塞锥形瓶中，加入甲醇与0.02 mol·L－1磷酸二氢钾溶液以体积比3∶7组成的混合液(萃取溶剂)10 m L，振荡1 min使样品充分浸润，超声萃取20 min，冷却至室温，于16 000 r·min－1转速下离心15 min，取上清液过0.22μm 过滤膜过滤后，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 仪器工作条件的选择

2.1.1 测定波长

按仪器工作条件采用二极管阵列检测器(DAD)扫描柚皮苷和苯甲酸地那铵的混合标准溶液，柚皮苷、苯甲酸离子和地那铵离子的紫外吸收光谱见图1。

图1 紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectra

由图1 可知:柚皮苷的最大吸收波长为282 nm，苯甲酸离子的最大吸收波长为230 nm，地那铵离子的最大吸收波长在210 nm 附近，但在波长210 nm 附近有紫外吸收的物质较多，易产生干扰，波长282 nm 处其余目标物的灵敏度太低。试验选择不同测定波长进行定性和定量，试验选择的测定波长见1.2节。

2.1.2 流动相

试验考察了甲醇-磷酸二氢钾溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液等3种流动相的洗脱效果。结果表明:上述3种流动相对柚皮苷和地那铵离子保留时间的影响较小；乙腈-磷酸二氢钾溶液为流动相时，柚皮苷和地那铵离子的响应强度优于甲醇-磷酸二氢钾溶液和乙腈-乙酸铵溶液为流动相时柚皮苷和地那铵离子的响应强度；使用甲醇-磷酸二氢钾溶液和乙腈-乙酸铵溶液作为流动相洗脱时，无苯甲酸离子色谱峰出现。综合考虑，试验选择流动相为乙腈-磷酸二氢钾溶液。

流动相的酸度对柚皮苷、苯甲酸离子和地那铵离子的色谱行为有影响，因此通过调节流动相的酸度以达到更好的分离。根据色谱柱适用的p H 范围(1～12)和苯甲酸地那铵的p Ka(4.05)，结合文献使用流动相磷酸二氢钾溶液的p H，固定柚皮苷和苯甲酸地那铵的质量浓度为10.0 mg·L－1，按仪器工作条件进行梯度洗脱，考察了流动相p H 分别为3.0，4.3，4.6，6.0时对柚皮苷、苯甲酸离子和地那铵离子分离的影响，结果见图2。

由图2可知:流动相p H 为3.0时，苯甲酸离子未出峰；流动相p H 为4.3及以上时，苯甲酸离子出峰。推测产生上述现象的原因:苯甲酸离子色谱行为的变化与其p Ka相关。在强酸性条件下，苯甲酸离子被质子化，在波长200 nm 以上均没有吸收。苯甲酸地那铵的p Ka为4.05，在流动相p H 为4.3及以上时，苯甲酸地那铵主要以离子状态存在，随着p H 的逐渐增大，离子型的含量增多，峰面积增大，极性增强，与反相色谱柱的保留能力减弱，保留时间减小。在流动相p H 大于4.3时，柚皮苷和地那铵离子的色谱峰随着流动相p H 增大，峰高降低，峰形变宽，对称性变差。综合考虑灵敏度、重现性和色谱峰的对称性，试验选择流动相p H 为4.3，用地那铵离子来定性和定量苯甲酸地那铵。

图2 流动相酸度对柚皮苷、苯甲酸离子和地那铵离子分离的影响Fig.2 Effect of acidity of mobile phase on separation of naringin，benzoate and denatonium

2.1.3 流动相流量

试验考察了流动相流量分别为0.2，0.3，0.4，0.5 m L·min－1时对柚皮苷和地那铵离子分离的影响，结果见图3。

由图3可知:当流动相流量从0.2 m L·min－1提高至0.5 m L·min－1时，柚皮苷和地那铵离子的分析时间由6.3 min减少至3.2 min，同时地那铵离子色谱峰拖尾现象严重。综合考虑分析效率和色谱峰的对称性，试验选择流动相流量为0.3 m L·min－1。

图3 流动相流量对柚皮苷和地那铵离子分离的影响Fig.3 Effect of flow rate of mobile phase on separation of naringin and denatonium

2.1.4 色谱柱柱温

试验考察了色谱柱柱温分别为30，35，40 ℃时对柚皮苷和地那铵离子分离的影响。结果表明:随着色谱柱柱温从30 ℃升至40 ℃，柚皮苷和地那铵离子的分析时间有所减少，并且在色谱柱柱温为40 ℃时，地那铵离子的色谱峰形尖且对称性好。考虑到分析效率和色谱柱的耐受性，试验选择色谱柱柱温为40 ℃。

2.2 萃取溶剂

试验考察了甲醇体积分数依次为10%，20%，30%的甲醇-0.02 mol·L－1磷酸二氢钾溶液为萃取溶剂时对柚皮苷和苯甲酸地那铵回收率的影响，结果见图4。

由图4 可知:萃取溶剂中甲醇的体积分数从10%增加至30%时，柚皮苷的回收率从25.0%提高至93.2%，苯甲酸地那铵的回收率在99.7%～101%之间；随着萃取溶剂中甲醇体积分数的增加，柚皮苷的回收率显著增加，苯甲酸地那铵的回收率保持稳定。综合考虑萃取效率和流动相的洗脱能力，试验选择萃取溶剂为甲醇与0.02 mol·L－1磷酸二氢钾溶液以体积比3∶7组成的混合液。

图4 甲醇的体积分数对柚皮苷和苯甲酸地那铵回收率的影响Fig.4 Effect of volume fraction of methanol on recovery of naringin and denatonium benzoate

2.3 标准曲线和检出限

按仪 器 工 作 条 件 对0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mg·L－1柚皮苷和苯甲酸地那铵的混合标准溶液进行测定，并绘制标准曲线。结果表明:柚皮苷和苯甲酸地那铵的质量浓度均在0.1～5.0 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表1。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，结果见表1。

表1 线性回归方程、相关系数和检出限Tab.1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.4 精密度和回收试验

以未检出柚皮苷和苯甲酸地那铵的儿童指画印泥样品作为空白样品，按照试验方法对其进行3个浓度水平加标回收试验，每个浓度水平平行测6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2可知:回收率为73.5%～104%，RSD 为4.2%～6.6%，能够满足定量分析的要求。

2.5 样品分析

按仪器工作条件测定了网购所得的10种儿童指画印泥样品中的柚皮苷和苯甲酸地那铵，柚皮苷和苯甲酸地那铵均未检出，不符合国家强制性标准GB 6675.14－2014《玩具安全 第14部分:指画颜料技术要求及测试方法》的要求。产生上述现象的原因可能是虽然国内外指画颜料标准强制要求添加苦味剂以避免儿童误食，但是并无相应测定方法标准发布。

本工作建立了超高效液相色谱法测定儿童指画印泥中柚皮苷和苯甲酸地那铵的分析方法。本方法快速简便，其线性范围、回收率、检出限、精密度均能满足EN 71-7:2014＋A2:2018、ISO 8124－7:2015和GB 6675.14－2014对苦味剂的限制要求。本方法的建立能为相关管理部门的监管提供测定依据，以促使生产企业依据标准进行设计和生产，保护我国未成年人的合法权益。