固相萃取-固相光谱联用仪的构建及其应用于食品中罗丹明B的测定

2020-06-01江成德杨仕骏倪晨杰陈万超杜一平

理化检验-化学分册 2020年2期

朱莹，李龙，江成德，边丽，杨仕骏，倪晨杰，陈万超，熊芩，杜一平∗

(1.华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室，上海200237； 2.上海屹尧仪器科技发展有限公司，上海201108)

分子光谱技术操作简便快速、仪器小巧、测定成本低，是理想的快检技术，但传统分子光谱技术在灵敏度和选择性方面还有一些局限性。文献[1-6]表明:将富集与光谱测定有机结合，即富集后免去洗脱步骤，在富集介质上直接进行光谱采集，简单快速。同时由于无洗脱，被测组分不会被再次稀释，富集倍数很高，可以大幅度提高测定方法的灵敏度，测定方法的选择性也有一定程度的提高，该技术被称为固相萃取光谱(SPES)[7]。

目前文献报道的SPES[8-9]采用的固相萃取装置和固相光谱测定装置是分开的，使用不便。将以膜材料为分离富集介质的固相萃取装置和以漫反射近红外-可见光谱为测定手段的固相光谱测定装置有机结合，建立了固相萃取-固相光谱联用仪。该仪器可提高样品处理、光谱测定的自动化程度，提高光谱分析方法的灵敏度和选择性。

罗丹明B是一种人工合成的碱性荧光染料，由于其廉价、染色性强且不易掉色而被不法商贩用于食品中。文献[10-12]表明:罗丹明B具有潜在的致癌、致畸性，中国卫生部已禁止罗丹明B 在食品及食品相关产品中使用。目前，食品中罗丹明B 的测定方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱法[13]和荧光探针法[14]等。这些测定方法均依赖昂贵仪器且需要复杂的前处理，耗时长，测定成本高。分光光度法[15]也可用于罗丹明B的测定，但该方法抗干扰能力差、线性范围窄、方法的精密度较低。本工作将研发的固相萃取-固相光谱联用仪用于食品中罗丹明B的快速测定，为食品中非法添加剂的快速测定提供一种快捷简便、成本低、自动化程度高的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

INSION UV/VIS 型微型光谱仪；INSION NIR 1.7型微型光谱仪；D0-IS30型便携式地物反射探头；PHS-25型数字型精密酸度计；SARTORIUS arium 611DI型超纯水净化系统；混合纤维素膜、尼龙膜、聚醚砜膜、亲水混合纤维素膜(孔径均为0.22μm)。

罗丹明B 标准储备溶液:100 mg·L－1，称取100 mg罗丹明B，用水溶解后定容至1.000 L，避光保存。

罗丹明B标准溶液:15.0μg·L－1，用p H 2.00的水逐级稀释100 mg·L－1罗丹明B 标准储备溶液，现用现配。

罗丹明B、硫酸、氢氧化钠均为分析纯；试验用水为超纯水(电阻率不小于18.2 MΩ·cm)。

1.2 固相萃取-固相光谱联用仪的构建

自主开发的固相萃取-固相光谱联用仪由固相萃取装置、固相光谱测定装置和软件等3个部分组成，其实物照片和结构示意图见图1，软件操作界面见图2。

固相萃取装置主要包括样品架、自动负压上样系统、固相萃取模块、滤液收集瓶、快速干燥系统等。滤膜和砂芯紧密密封，保证进样溶液不泄漏。样品溶液通过负压自动上样，可调节真空度选择合适的过滤速率，满足上样要求。滤液通过管路进入滤液瓶。待测物质被富集在膜上后，采用热空气对滤膜进行快速干燥，干燥后的滤膜直接用于后续的固相光谱测定。

图1 固相萃取-固相光谱联用仪的实物照片和结构示意图Fig.1 Physical photo and structure chart of hyphenated instrument solid phase extraction and solid phase spectroscopy

图2 软件操作界面Fig.2 Software operation interface

固相光谱测定装置包括光纤、光谱仪和积分球。积分球用于漫反射固相光谱的采集。固相光谱测定装置能与固相萃取装置完美搭配，完成固相萃取操作后在固相介质表面平稳和准确地采集固相光谱。

软件具备仪器控制、光谱采集和数据处理等功能。软件控制架构见图3。

图3 软件控制架构Fig.3 Software control architecture

通过主机软件控制真空泵，进行负压上样操作；通过主机软件控制热风枪，进行滤膜干燥操作；主机软件与光谱仪通讯，读取仪器内部温湿度信息，进行环境监控，确保工作环境的正常；通过主机软件向光谱仪下达指令，采集光谱信息；主机软件对采集的数据进行处理及分析，生成报告。

1.3 试验方法

称取0.500 g市售辣椒样品，加入50.0 m L 水，超声10.0 min，离心后取上清液，得到样品溶液(辣椒提取液)。

红茶样品无需处理，可直接作为样品溶液。

将混合纤维素膜放置在砂芯上，加置滤杯和溶剂输入装置。取50.0 m L 预先用硫酸调p H 至2.00的样品溶液置于样品架上。打开软件，开启真空泵，控制真空度为0.06 MPa，负压上样。样品溶液经管道富集到微孔滤膜(混合纤维素膜)上，滤液流至收集瓶中。进样完成后，取出滤膜，热风干燥。干燥后的滤膜无需洗脱，直接在线采集滤膜上的样品点(罗丹明B)的可见光谱，取波长546.7 nm 处的吸光度，进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 试验条件的选择

2.1.1 微孔滤膜种类

按试验方法考察了混合纤维素膜、尼龙膜、亲水混合纤维素膜、聚醚砜膜等4种常用微孔滤膜对罗丹明B富集性能的影响。结果表明:只有混合纤维素膜对罗丹明B有良好的富集效果，其他种类的微孔滤膜对罗丹明B没有明显的富集效果，光谱信号很弱。试验选择微孔滤膜为混合纤维素膜。

2.1.2 测定波长

按试验方法将15.0μg·L－1罗丹明B 标准溶液富集到混合纤维素膜上，干燥后测得的固相光谱见图4。

图4 富集罗丹明B膜的固相光谱Fig.4 Solid phase spectrum of membrane enriched rhodamine B

该光谱与课题组前期工作[8]报道的结果，以及罗丹明B 溶液测定的透射光谱很接近。试验选择测定波长为546.7 nm。

2.1.3 样品溶液的体积

膜富集试验中，富集的样品溶液的体积对方法灵敏度有影响。试验中分别用微孔滤膜富集10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0，100.0，110.0 m L的15.0μg·L－1罗丹明B 标准溶液(p H 2.00)，待滤膜干燥后，采集各滤膜上样品点的可见光谱，样品溶液体积对罗丹明B 吸光度的影响见图5。

图5 样品溶液体积对罗丹明B吸光度的影响Fig.5 Effect of sample solution volume on absorbance of rhodamine B

由表5可知:随着样品溶液体积的增加，罗丹明B的吸光度逐渐增加；当样品溶液体积增加到60.0 m L时，继续增加样品溶液的体积，罗丹明B的吸光度基本平稳。试验选择样品溶液的体积为50.0 m L。

2.1.4 样品溶液的酸度

样品溶液酸度的改变会引起溶液中目标物分子的质子化和去质子化，进而改变目标物在溶液中的溶解度，影响膜富集过程。试验考察了样品溶液的p H 为1.00～9.00 时对膜富集罗丹明B 过程的影响。结果表明:p H 为1.00时，罗丹明B的吸光度最大；继续增大p H，罗丹明B的吸光度逐渐降低。这是因为罗丹明B 分子中的羧基在强酸条件下不易解离，与微孔滤膜的结合能力较强。考虑到p H 为1.00～3.00时，罗丹明B吸光度的差异不大，p H 为2.00时，平行测定结果误差较小，试验选择样品溶液的酸度为p H 2.00。

2.2 干扰试验

试验考察了样品中可能存在的K＋、Na＋、Ca2＋、Cu2＋、NO3－、Cl－、SO42－等无机离子和孔雀石绿、荧光素、碱性橙等多种有机染料对罗丹明B测定的干扰。当干扰物的存在引起罗丹明B 测定信号的相对误差在±5%以内时，无机离子的允许量(以倍数计)为300～4 500，有机染料的允许量小于10。这说明建立的方法对一些常见无机离子的抗干扰能力较强，对有机染料的抗干扰能力较弱。

2.3 标准曲线和检出限

按试验方法对4.0～40.0μg·L－1的罗丹明B标准溶液系列进行富集并采集其光谱，绘制标准曲线。结果表明:罗丹明B的质量浓度与其对应的吸光度呈二次函数关系，回归方程为y ＝5.97×10－1x2＋5.45×10－1x＋1.06×10－2，相关系数为0.994 5。在高质量浓度范围内，罗丹明B 的富集容易趋于饱和，因此呈现二次函数关系；在4.0～20.0μg·L－1内(低质量浓度)，罗丹明B 的质量浓度与其对应的吸光度呈线性关系，线性回归方程为y ＝4.49×10－3x ＋1.29×10－2，相关系数为0.995 5。

为消除基体背景干扰，分别以辣椒提取液和红茶作为基体，加入罗丹明B 标准储备溶液，配制了罗丹明B 基体标准溶液系列。按试验方法对上述罗丹明B基体标准溶液系列进行测定，以罗丹明B的质量浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。罗丹明B的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。

按试验方法测定空白样品9次，计算标准偏差(s)，按3倍标准偏差除以标准曲线斜率计算方法的检出限(3s/k)，结果见表1。