高效液相色谱法同时测定烟用甘草提取物中14种活性成分

王丽达，蒋成勇，杨振民，易小丽，芦 楠，严莉红

(上海烟草集团有限责任公司 技术中心北京工作站，北京100121)

甘草提取物作为药用型添加剂已被广泛用于烟草、医药、食品、化妆品等行业，其活性成分主要有三萜皂苷类化合物(甘草酸、甘草次酸等)、甘草黄酮、甘草多糖等，具有补脾益气、滋咳润肺、清热解毒、调和诸药等功效[1-4]。烟草中的甘草提取物可有效降低卷烟烟气中的自由基等有害化合物，显著提高卷烟产品的安全性[5-6]，还可以起到增香、保润的作用[7-8]。

目前，烟用甘草提取物的质量监控主要通过折光指数、相对密度、酸值等理化指标及安全性这两个环节来控制。常规的质量判定不能准确反映甘草提取物的内在质量及其波动，也不能从化学组成的角度对其中活性成分的差异做出定性、定量的解释[9-11]。因此，监测活性成分的含量变化，对于控制烟用甘草提取物进货质量、保障卷烟产品质量的稳定具有相当重要的应用意义。

甘草提取物中活性成分的测定方法主要有比色法[12]、薄层扫描法[13]、毛细管电泳法[14]和液相色谱法[15-17]等。但是，大多数文献报道仅局限于测定甘草提取物中的一种或几种成分[18-20]，无法满足烟用甘草提取物中活性成分快速测定的要求。

本工作采用高效液相色谱法同时测定烟用甘草提取物中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、新异甘草苷、甘草查尔酮B、甘草素、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草酸、甘草香豆素、甘草查尔酮A、光甘草定和甘草次酸等14种活性成分的含量，旨在为进一步研究烟用甘草提取物质量监控、提升卷烟产品内在质量提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Accela型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；HNY-100D 型恒温振荡器；D-78224型超声波清洗仪；Milli-Q 型超纯水仪。

14 种活性成分的混合标准储备溶液:含60.6 mg·L－1芹糖甘草苷、50.4 mg·L－1甘草苷、63.6 mg·L－1芹糖异甘草苷、47.0 mg·L－1异甘草苷、45.8 mg·L－1新异甘草苷、28.0 mg·L－1甘草查尔酮B、45.4 mg·L－1甘草素、36.8 mg·L－1刺甘草查尔酮、48.6 mg·L－1异甘草素、557.4 mg·L－1甘草酸、19.0 mg·L－1甘草香豆素、20.2 mg·L－1甘 草 查 尔 酮 A、47.0 mg·L－1光 甘 草 定 和34.0 mg·L－1甘草次酸，称取适量的14 种活性成分的标准品，用80%(体积分数，下同)甲醇溶液稀释而成。

芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷标准品的纯度不小于96%，甘草苷、异甘草苷、甘草查尔酮B、甘草素、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸标准品的纯度不小于98%，甘草酸标准品的纯度大于93%，新异甘草苷、甘草香豆素标准品的纯度不小于97%。

所用试剂均为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

Diamonsil Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱温30 ℃；流量1 m L·min－1；进样体积为10μL。流动相:A 为0.05%(体积分数)磷酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序:0～3.0 min 时，A 由80%降至73%，保持12.0 min；15.0～17.0 min时，A 由73%降至66%；17.0～22.0 min时，A 由66%降至65%；22.0～30.0 min时，A 由65%降至45%；30.0～48.0 min 时，A 由45%降至20%。检测波长:276 nm(0～7.0 min)、360 nm(7.0～11.5 min)、276 nm(11.5～16.0 min)、360 nm(16.0 ～27.5 min)、248 nm(27.5～31.0 min)、360 nm(31.0～35.0 min)、276 nm(35.0～38.0 min)、248 nm(38.0～48.0 min)。

1.3 试验方法

称取0.100 0 g的取自某卷烟厂化材库的甘草提取物样品于25 m L 锥形瓶中，用移液器加入10 m L的80%甲醇溶液，超声提取30 min 后静置30 min，取上清液经0.45μm 滤膜过滤后，按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件对14种活性成分的混合标准溶液进行测定，其色谱图见图1。

图1 14种活性成分混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 14 active constituents

按试验方法对烟用甘草提取物样品和加标后的烟用甘草提取物样品进行分析，烟用甘草提取物样品加标前后的色谱图见图2。

图2 烟用甘草提取物样品加标前后的色谱图Fig.2 Chromatograms of the sample of tobacco licorice extract before and after addition of mixed standard solution

2.2 提取方法的选择

试验采用超声(1，10，20，30，40，50 min)和振荡(0.5，1，2，3，4，5 h)两种提取方法分别对同一批次烟用甘草提取物样品进行分析，超声提取时间对目标物总量的影响见图3。

图3 超声提取时间对目标物总量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on total amount of the target objects

由图3可知:超声提取30 min后，目标物的提取基本可以完成。振荡提取烟用甘草提取物样品中的活性成分时，目标物总量偏低，提取效率略低。超声提取利用超声波产生的强烈振动、空化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增加溶剂穿透力，加速溶质的释放、扩散和溶解，可以提高提取效率，有效缩短提取时间。试验选用超声提取。

2.3 超声提取条件的选择

2.3.1 提取溶剂

称取0.100 0 g同一批次烟用甘草提取物样品于25 m L锥形瓶中，分别加入10 m L 甲醇、乙醇、水、乙腈、异丙醇作为提取溶剂，超声提取30 min。上述5种提取溶剂提取烟用甘草提取物时，目标物的总量依次 为23.46，4.68，27.89，6.32，3.45 mg·g－1，提取溶剂的提取能力顺序为:水＞甲醇＞乙腈＞乙醇＞异丙醇。其中甲醇对甘草素、异甘草素、甘草酸的提取效率最好，水对芹糖甘草苷、甘草苷的提取效率最好，不同成分在不同溶剂中的溶解度不一样。试验选用甲醇和水的混合液作为提取溶剂。

试验考察了甲醇溶液的体积分数依次为90%，80%，70%，50%，20%时对目标物总量的影响。结果表明:分别以90%，80%，70%，50%，20%甲醇溶液为提取溶剂时，目标物的总量依次为27.76，31.68，30.61，28.71，28.17 mg·g－1，80%的 甲 醇 溶液提取效果最好。试验选择提取溶剂为80%甲醇溶液。

2.3.2 提取溶剂的用量

试验考察了80%甲醇溶液的用量依次为3，5，10，15，20，30，40 m L时对目标物总量的影响，结果表明:80%甲醇溶液用量依次为3，5，10，15，20，30，40 m L 时，目标物总量依次为30.62，30.65，31.68，31.74，31.82，31.83，31.85 mg·g－1。目标物总量变化并不显著，说明烟用甘草提取物的活性成分较易提取。由于甘草香豆素的含量较低，提取溶剂用量为15 m L时，所对应的峰面积较小，误差较大，同时提取溶剂为10，15 m L 时，提取效果相当。试验选择提取溶剂的用量为10 m L。

2.3.3 正交试验

为进一步考察提取溶剂中甲醇与水的比例(A)、提取时间(B)、提取溶剂用量(C)等因素对超声提取烟用甘草提取物活性成分总量的影响，根据单因素试验结果，以总提取量为指标，采用L9(33)正交法设计试验。正交试验结果见表1。

表1 正交试验结果Tab.1 Results of orthogonal test

由表1可知:各因素对目标物总量的影响顺序为提取溶剂＞提取溶剂用量＞提取时间。因此，超声提取的最佳方案为A2B2C3，提取溶剂为80%甲醇溶液。因为甘草香豆素在15 m L 提取溶剂中峰面积较小，误差较大，同时10 m L 和15 m L 用量的提取效果相当，试验选用10 m L 提取溶剂，在超声条件下提取30 min。

正交试验方差分析结果见表2，其中“∗∗”表示提取溶剂中甲醇体积分数的改变对活性成分提取总量显著性相关。

表2 正交试验方差分析结果Tab.2 Results of variance analysis of orthogonal test

根据正交试验方差分析结果进行F 检验，结果表明:提取溶剂中甲醇体积分数的改变对活性成分提取总量有显著影响；另外两种因素对提取总量无显著影响。因此，不必再进行各因素水平间的多重比较。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按色谱条件对14种活性成分的混合标准溶液系列进行测定，以14种活性成分的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。14种活性成分的线性范围、线性回归方程和相关系数见表3。

以3倍标准偏差和10倍标准偏差分别作为方法检出限(3s)和测定下限(10s)，结果见表3。

表3 线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收试验

按试验方法对烟用甘草提取物样品进行分析，同时进行加标回收试验，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

表4(续)

由表4可知:回收率为91.7%～143%，RSD 为1.2%～6.0%。

2.6 方法的稳定性

将烟用甘草提取物样品密闭于2 m L棕色色谱小瓶中，于4 ℃冷藏保存，分别在第1，2，3，4，5 d按试验方法进行分析。结果表明:第1，2，3，4，5 d的目标 物 总 量 依 次 为31.68，31.65，31.87，31.83，31.69 mg·g－1。

随着样品放置时间的延长，目标物总量并没有发生明显改变，说明提取后的样品稳定，本方法稳定性较好。

2.7 样品分析

按试验方法对10个连续进货批次的烟用甘草提取物样品进行分析，结果见表5。

表5(续) mg·g－1

由表5可知:不同烟用甘草提取物样品的活性成分含量存在明显差异。这是由于甘草提取物的质量受原材料产地、土壤、种质、炮制、保存、制剂过程等因素的影响，其活性成分含量会有很大差异，甘草提取物添加到卷烟产品后，会直接影响卷烟产品质量的稳定性。

本工作建立了高效液相色谱法同时测定烟用甘草提取物中14种活性成分含量的方法。本方法操作简便、准确度高、重复性好，可适用于烟用甘草提取物中活性成分的快速测定，并且可为烟用甘草提取物的品质监控提供技术支持。