沉默MARCH2通过ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR轴调控结肠癌细胞自噬

夏 丹，孟 琴

细胞自噬是细胞依赖溶酶体对自身胞质组分进行降解的重要途径，不仅对细胞应激、病原体清除至关重要，也参与生物个体的生长、发育和衰老过程[1]。内质网应激是一个有效的自噬诱导因素[2]。但对联系这两个不同细胞内通路间的信号或分子尚缺乏了解。近年研究发现，自噬水平变化引起的细胞功能改变是肿瘤发生、发展中的重要环节，与结肠癌的发病密切相关[3-4]。MARCH2(the membrane associated RING-CH 2)是跨膜RING-CH finger蛋白，具有多种生物学功能，如免疫调节、蛋白质控和膜运输。鉴于MARCH2主要定位于内质网，本文着重探讨MARCH2是否通过内质网应激调控自噬，为潜在的临床结肠肿瘤应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料MARCH2、IRE1α和PERK抗体购自美国Abcam公司；LC3B和BafilomycinA1购自Sigma Aldrich公司；ATG5、CHOP、EIF2α、ATF4和p-EIF2α抗体购自美国CST公司；GRP78抗体购自Bioss公司；p-PERK和ATF6α(F-7)抗体购自Santa Cruz公司；XBP1s抗体购自Biolegend公司；ATF6抗体购自Imagnex公司；TRIB3抗体购自Novus Biologicals公司。

1.2 RNA干扰MARCH2 shRNA：5′-GATCCGTG GCTTTCCTCATCTAACTTCAAGAGAGTTAGATGAGG AAAGCCACTTTTTTGGAAA-3′和5′-AGCTTTTCCAA AAAAGTGGCTTTCCTCATCTAACTCTCTTGAAGTTAG ATGAGGAAAGCCACG-3′；ATF4 siRNA：5′-TCCCT CAGTGCATAAAGGA-3′；CHOP siRNA：5′-GCCTGG TATGAGGACCTGC-3′；TriB3 siRNA：5′-GCUCU CAGCUCCUAUACACTT-3′。

1.3 细胞培养及转染HCT116细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中，常规传代。shRNA及其转染用Lipofectamine 2000，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 构建沉默MARCH2稳定的细胞系将shMARCH2或shControl转染结肠癌HCT116细胞，经过嘌呤霉素(10 μg/mL)筛选得到沉默MARCH2的稳定细胞系。

1.5 RT-PCR收获不同细胞，提取总RNA，用Reverse Transcript Kit(Invitrogen公司)逆转录合成单链cDNA文库。PCR使用的引物详见表1。

表1 RT-PCR引物

1.6 Western blot法HCT116细胞总蛋白的提取，蛋白定量，5%牛奶(TBST液配制)室温封闭1 h；加入相应的一抗，4 ℃过夜；然后加入相应的DyLight 680/800标记的二抗(1 ∶10 000)，室温避光反应1 h；用Odyssey Infrared Imager检测荧光信号并分析灰度值。

1.7 统计学分析应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，组间比较采用Studentt检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默MARCH2对结肠癌细胞自噬水平的影响本实验构建MARCH2 shRNA，将shMARCH2或shControl转染结肠癌HCT116细胞，经过嘌呤霉素以适合的浓度筛选得到沉默MARCH2的稳定细胞系，并对其有效性进行mRNA及Western blot水平鉴定(图1)，结果显示MARCH2 shRNA能有效敲减细胞中MARCH2 mRNA及蛋白水平，证实合成的shMARCH2有效。

与对照组相比，敲减MARCH2能升高内源性LC3B-Ⅱ的水平(图2)。增高的LC3B-Ⅱ可能源于自噬体生成的增多或降解的减少，为了区分这两种可能性，实验使用了自噬体晚期抑制剂巴弗洛霉素A1(BafA1，抑制囊泡H+-ATPase，溶酶体酸化受抑，从而阻碍自噬体与溶酶体的融合)。结果显示，经BafA1处理(孵育6 h)阻断溶酶体降解后，与对照组相比，MARCH2沉默细胞中内源性LC3B-Ⅱ的水平进一步升高(图2)，表明MARCH2沉默促进了自噬体的生成，而非阻断其降解。结果表明MARCH2表达沉默在本底水平能促进自噬。

图1 MARCH2 shRNA的鉴定：1.shControl；2.shMARCH2

图2 Western blot法检测LC3B-Ⅱ的水平变化*P<0.05，**P<0.01

2.2 沉默MARCH2对内质网应激信号通路的影响鉴于内质网应激是调控自噬通路之一，且MARCH2主要定位于内质网。本组实验分别检测内质网应激PERK、ATF6和IRE1α信号通路，Western blot法结果显示，在沉默MARCH2的HCT116细胞中，包括p-PERK、p-eIF2α和ATF4等UPR分子表达水平升高，同时伴随着ATG12-ATG5结合物的增多(图3A)。此外，实验发现切割的ATF6、p-IRE1α和XBP1s在沉默MARCH2的HCT116细胞中表达水平也有轻度上调。与这些结果相一致的是，ER应激传感蛋白GRP78在沉默MARCH2的HCT116细胞中也有升高(图3B)，提示沉默MARCH2引起的PERK、ATF6和IRE1α通路的活化可能促进MARCH2介导的自噬。

图3 沉默MARCH2对内质网应激的作用：A.p-PERK、p-eIF2α和ATF4等表达水平升高；B.ATF6、p-IRE1α和XBP1s等表达水平轻度上调

2.3 MARCH2通过ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR轴调控自噬首先检测沉默MARCH2对AKT-MTOR信号通路及TRIB3水平的影响；然后敲减CHOP，检测TRIB3水平；敲减TRIB3，检测AKT-MTOR信号通路；敲减ATF4，检测TRIB3、CHOP、ATG12-ATG5、AKT-MTOR信号通路，明确MARCH2是否通过ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR轴调控自噬。结果显示，沉默MARCH2的结肠癌HCT116细胞中AKT-MTOR信号减弱，TRIB3、CHOP和ATG12-ATG5结合物蛋白水平升高(图4)，提示沉默MARCH2可能通过上调CHOP，从而升高TRIB3，导致AKT-MTOR抑制，最终促进自噬发生。

为进一步确认，应用siRNA敲减CHOP，发现沉默CHOP会引起TRIB3的蛋白水平降低(图5)。接着敲减了TRIB3，发现AKT-MTOR信号有所回升(图6)。最后敲减ATF4，发现CHOP和TRIB3蛋白水平降低，AKT-MTOR信号回升，ATG12-ATG5结合物水平降低(图7)。上述结果表明，ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR轴在沉默MARCH2诱导自噬发生过程中起到非常重要的作用。

3 讨论

MARCH家族是一个结构上相关联的蛋白家族，其成员结构特点为由N端的RING-CH结构域和紧连的C端两个或多个跨膜区组成。这种跨膜RING-CH指蛋白具有多种生物学功能，如免疫调节、蛋白质控和膜运输等。目前MARCH家族有11个成员(MARCH-I-XI)。其中MARCH-I可介导MHC-Ⅱ泛素化，是胸腺中T细胞发育的重要调节因子。MARCH-X和MARCH-XI参与精子的形成和发育。MARCH-Ⅱ基因是Bartee课题组[5]于2004年发现，MARCH-Ⅱ能降解细胞表面受体如转铁蛋白受体和共刺激分子B7.2(CD86)。应用免疫荧光观察到MARCH蛋白与内质网以及溶酶体共定位[5]。鉴于内质网应激是调控自噬通路之一[6-7]，且MARCH2主要定位于内质网[5]，沉默MARCH2是否通过引起内质网应激从而触发自噬过程？内质网膜上存在PERK、ATF6和IRE1α三个内质网应激反应感受分子[8-9]。PERK/eIF2a途径是UPR信号通路之一，不发生内质网应激时，PERK与GRP78/Bip以未活化的形式结合，内质网应激发生时，PERK与GRP78分离而活化，从而磷酸化其下游的eIF2α，导致eIF2α失活，终止细胞内绝大多数蛋白的合成，并调节下游细胞周期。PERK/eIF2a通路也激活ATF4，引起CHOP表达。活化的IRE1α可作为RNase激发XBP1 mRNA转录，成为UPR靶基因(如GRP78/BiP和钙网蛋白)的转录激活因子。持久的UPR会活化PERK，进而磷酸化eIF2α，抑制细胞内mRNA转录。有研究表明，IRE1α和PERK可以激活细胞保护性胞内降解系统——自噬，做为替代途径降解细胞内积累的错误折叠蛋白。同时，在内质网应激过程中，ATF6从Bip上解离可以从内质网转位到高尔基体，裂解的ATF6转移到核激活不同的分子伴侣和内质网应激标志物如CHOP[7-9]。

图4 Western blot法检测AKT-MTOR信号通路及TRIB3蛋白水平：1.shControl；2.shMARCH2

图5 沉默CHOP对TRIB3蛋白表达水平的影响

图6 敲减TRIB3对AKT-MTOR信号的影响

图7 Western blot法检测ATF4、CHOP、TRIB3、AKT-MTOR信号通路蛋白及ATG12-ATG5结合物水平的变化

TRIB3是新的内质网应激诱导基因，TRIB3的表达升高可以由CHOP诱导，并触发磷酸化AKT的抑制[10]。

本组实验结果显示，沉默MARCH2的结肠癌HCT116细胞中AKT-MTOR信号减弱，而TRIB3、CHOP和ATG12-ATG5结合物蛋白水平升高。沉默CHOP会引起TRIB3的蛋白水平降低；敲减TRIB3引起AKT-MTOR信号有所回升；敲减ATF4导致CHOP和TRIB3蛋白水平降低，AKT-MTOR信号回升，ATG12-ATG5结合物水平降低。本实验结果显示，沉默MARCH2可能通过上调CHOP，从而升高TRIB3，导致AKT-MTOR抑制，最终促进自噬发生。ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR轴在沉默MARCH2诱导自噬发生过程中具有重要作用。