正常宫颈、CIN、宫颈鳞癌中P-gp、MRP1、Survivin的相关表达及对新辅助化疗作用的研究

陈 芬 彭瑞宇 孟 佳 张丽萍

1 昆明爱维艾夫医院，云南省昆明市 650000； 2 华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)；3 湖北医药学院附属太和医院

宫颈癌是全球范围排名第4位的常见恶性肿瘤，也是女性面临的主要健康问题[1]，严重影响患者的生活质量。其中，子宫颈癌类型中以鳞状细胞癌最为常见，占 75%～80%，其次为腺癌，其他病理类型的宫颈癌较为少见[2]。宫颈癌的传统治疗方法是根治性手术和放化疗，ⅠA期～ⅡA期宫颈癌患者的治疗方式以手术治疗为主，其优点是年轻患者可以选择性地保留卵巢和阴道的部分功能；ⅡB期及以上患者以放疗为主；晚期和复发转移的患者，主要采取化学疗法。宫颈癌新辅助化疗(Neoadjuvant chemotherapy，NACT)是近年才兴起的宫颈癌治疗方案。由Frei[3]在1982年首先提出新辅助化疗的概念，即对于临床表现为巨块型或局部晚期的患者，在手术前或放疗前先使用化疗，以利于局部治疗手段的实行。化疗虽然可以提高治疗效果，可是由化疗产生的耐药性是导致化疗失败的关键原因之一。在实施新辅助化疗方案时，需提前考虑化疗对于该患者是否有效。P-gp、MRP1、Survivin是与耐药相关的三种基因蛋白，本研究通过联合检测三者在正常宫颈、CIN以及宫颈鳞癌新辅助化疗前后的表达，探讨其在新辅助化疗中的作用，进而为采取有效的治疗方案提供相关的依据，以便更好地指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 标本来源和相关临床资料 收集我院2016年2月—2017年3月间相关标本，经本院病理科活检确诊为：正常宫颈组织15例，CIN组织15例(无特殊疾病)，以及宫颈癌患者的标本，其中符合在本院行新辅助化疗前均未行任何化疗、放疗和免疫治疗的初治患者，及新辅助化疗后行手术切除的石蜡配对标本共30例。所有患者的病理切片均由资深病理科专家复阅宫颈癌HE病理切片并再次确诊。采用国际妇产科联盟(FIGO，2009)[4]临床分期标准：宫颈癌Ⅰb2期10例，Ⅱa期20例，总共30例。且均符合：初治患者(未接受过化疗、放疗和免疫治疗)；患者年龄26～64岁，平均年龄为46.24岁；癌灶直径≥4cm；血WBC≥4×109/L，PLT≥10×109/L；心肺肝肾及凝血功能均无异常；无其他恶性肿瘤病史。所选病例均行开普拓(CPT-Ⅱ)联合顺铂(DDP)静脉滴注的化疗方案，具体用法[5]：CPT-Ⅱ60mg/m2,化疗第1、8、15天静脉滴注；DDP 60mg/m2,仅第1天静脉滴注，并常规水化。每个疗程间隔时间28d。化疗1个疗程后观察患者的近期临床疗效。化疗总疗程结束后14d，各项生化指标恢复接近正常水平时，行广泛全子宫切除及盆腔淋巴结清扫术，并留取组织石蜡封存。

1.2 NACT临床疗效判定 化疗结束后2周，根据妇检、妇科阴道B超来测量宫颈癌灶的大小变化，以此判断其行新辅助化疗后的近期临床疗效。根据国际抗癌协会(UICC)疗效判定标准：完全缓解(Complete remission，CR)：可见的肿瘤病变完全消失，维持4周以上；部分缓解(Partial remission，PR)：肿瘤病灶的最大直径及其最大的垂直横径的乘积缩小>50%以上，其他病灶无增大，无新病灶出现，维持4周以上；稳定(Stable disease，SD)或无变化(No change，NC)：肿瘤病灶的两径乘积缩小不足50%，或增大不超过25%，无新病灶出现，维持4周以上；进展(Progressive disease，PD)：肿瘤病灶的两径乘积增大25%以上或出现新病灶。临床有效=CR+PR；临床无效=SD+PD。

1.3 实验方法和主要试剂 采用免疫组化S-P法(采用生物素标记的第二抗体，使之与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质色素混合，并利用此混合液来测定细胞和组织中的抗原成分)及自动图像分析系统来检测。经载破片、组织切片、微波抗原修复等步骤获取石蜡切片。P-gp、MRP1单克隆抗体及Survivin多克隆抗体及SP试剂盒均购于福建迈新生物科技有限公司。分别用PBS缓冲液代替3种一抗作为阴性对照，并用已知的阳性病理切片作为阳性对照片。运用Image Pro Plus 6.0自动图像分析系统,于×200倍镜下，随机选取5个视野,系统自动随机测定每个视野3个不同的部位,最后提取阳性细胞,测定平均光密度值(OD) 。

1.4 免疫组化结果的相关判定 P-gp、MRP1阳性染色颗粒位于胞膜和(或)胞浆中，Survivin阳性染色颗粒定位于细胞浆。阳性结果为胞膜和(或)胞浆中出现淡黄至棕黄色颗粒为阳性。阳性信号运用Image Pro Plus 6.0自动图像分析系统,于×200倍镜下，随机选取5个视野,系统自动随机测定每个视野3个不同的部位,最后提取阳性细胞,测定平均光密度值(OD) 。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析，采用t检验、χ2检验及单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常宫颈组织、CIN及化疗前宫颈鳞癌中P-gp、MRP1、Survivin的表达 P-gp、MRP1、Survivin从正常宫颈组织到CIN再到宫颈鳞癌，三者阳性表达量是显著升高的，且在宫颈鳞癌组织中表达最高,具体见表1。

表1 P-gp、MRP1、Survivin在正常宫颈组织、CIN和宫颈鳞癌中的表达

注：P<0.01，差异有显著的统计学意义。

2.2 P-gp、MRP1、Survivin在宫颈鳞癌新辅助化疗前后的表达 新辅助化疗前、后P-gp、Survivin的OD值比较差异有统计学意义，MRP1化疗前后差异无统计学意义,具体见表2及图1～6。

表2 P-gp、MRP1、Survivin在宫颈鳞癌新辅助化疗前后的表达

2.3 P-gp、MRP1、Survivin的表达与新辅助化疗近期临床疗效之间的关系 P-gp在新辅助化疗有效组中的表达量显著低于无效组中的表达量(P<0.01)；MRP1在新辅助化疗有效组中的表达量与无效组中的表达量无差别(P>0.05)；Survivin在新辅助化疗有效组中的表达量显著低于无效组中的表达量(P<0.01)，具体见表3。

表3 P-gp、MRP1、Survivin 在NACT化疗后的表达与近期临床疗效之间的关系

图1 P-gp在宫颈鳞癌化疗前的阳性表达S-P×200

图2 P-gp在宫颈鳞癌化疗后的阳性表达S-P×200

图3 MRP1宫颈鳞癌化疗前阳性表达S-P×200

图4 MRP1宫颈鳞癌化疗后阳性表达S-P×200

图5 Survivin宫颈鳞癌化疗前阳性表达S-P×200

图6 Survivin宫颈鳞癌化疗后阳性表达S-P×200

3 讨论

目前宫颈癌的主要治疗方法是手术和放疗，但其临床预后效果并不理想，随着新辅助化疗的广泛应用，其化疗疗效也越来越明显[6]。新辅助化疗可以缩小肿瘤病灶，降低癌细胞的宫旁浸润程度，使部分丧失手术机会的患者再次获得手术机会，同时也可以增强其对放疗的敏感性。化疗虽然可以提高治疗效果，可是由化疗产生的耐药性是导致化疗失败的关键原因之一。对于化疗不敏感的患者实施新辅助化疗，可能导致病情进一步加重，从而延误最佳治疗时机。因此，由于耐药导致的化疗失败在很大程度上限制了新辅助化疗药物的选择和使用。

P-糖蛋白是一种能量依赖性且具有跨膜外排泵作用的糖蛋白。是多药耐药基因 MDR-1的编码产物，经ATP水解供能将药物主动转运出胞外，最终导致肿瘤耐药[7]。应瑜等在对50例Ⅰb2-Ⅱb期宫颈癌患者的研究中表明化疗后P-gp在宫颈鳞癌阳性表达率显著升高，由化疗前56%上升到85%(P<0.05)，且在 P-gp阳性表达的患者中化疗有效率为39.29%，阴性表达的患者中化疗有效率高达100.00%[8]。本研究发现P-gp在正常宫颈组织、CIN及宫颈鳞癌中均有不同程度的表达，且正常宫颈组织

多药耐药相关蛋白MRP是一种跨膜转运糖蛋白，介导肿瘤细胞的多药耐药，目前已发现9个成员，其中MRP1与肿瘤细胞的多药耐药关系最为密切[9]。其机制可能是随着化疗疗程的延长肿瘤细胞内MRP1基因过度表达或肿瘤细胞本身存在过度表达的MRP1基因，导致化疗药物被泵出细胞外，从而产生肿瘤耐药[10]。本研究发现MRPl在正常宫颈组织、CIN及新辅助化疗前宫颈鳞癌组织中均有不同程度的表达，MRPl在新辅助化疗前的宫颈鳞癌组织中的表达>CIN>正常宫颈组织(P<0.01)。MRPl在正常组织中的表达，考虑与机体的自身保护机制有关，为正常生理功能的体现。本研究还发现，MRPl在初治宫颈鳞癌组织中表达高，说明宫颈鳞癌也是MRPl的高表达肿瘤，可能存在MRPl介导的原发性耐药。本研究中宫颈鳞癌患者新辅助化疗后，MRPl的阳性表达量虽然有升高，但是新辅助化疗并没有明显促进MRPl的表达(P>0.05)。进一步说明，化疗后MRPl的高表达，并不是由于新辅助化疗药物诱导所致。因此我们认为，多药耐药相关蛋白1(MRPl)可能仅介导宫颈鳞癌的原发性耐药，不参与继发性耐药。

Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，在肿瘤细胞增殖、凋亡以及血管形成过程中发挥重要作用[11]。且Survivin在组织中的表达具有很明显的特点，其在正常组织无表达或低表达，在大多数终末分化组织中缺失或低表达，而在大多数人实质性肿瘤和血液恶性肿瘤中强表达，与肿瘤的发病、浸润及预后密切相关[12-13]。Wall等[14]研究证实，Survivin Thr34磷酸化对维持细胞分裂、保持细胞活性是必不可少的，将不能磷酸化的人工突变体T34导入宫颈癌细胞株内，可诱导细胞凋亡，增加对化疗的敏感性。本研究表明，Survivin在正常宫颈组织中呈现低表达或者不表达状态，Survivin正常宫颈组织的表达量

综上所述，由P-gp、MRP1、Survivin介导的多药耐药，与新辅助化疗的临床疗效密切相关，其平均光密度值表达越高，预示着化疗效果越差。因此联合检测多个耐药相关蛋白，可以更好地指导临床化学用药，选择有效的个体化治疗方案。但是由于本研究的研究对象例数较少，其临床指导价值需要大样本多中心对照研究。