复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠作用机制研究

张 媛 徐 红

随着人们生活水平的提高，饮食结构发生改变，原发性高尿酸血症的发病率不断升高，且发病年龄逐渐低龄化[1-2]。高尿酸血症是尿酸性肾病的生化基础，流行病学调查结果显示，高尿酸血症人群的慢性肾脏病发病率明显高于血尿酸正常人群[3]。目前西药治疗尿酸性肾病虽有确切的疗效，但同时也存在着较为严重的不良反应，部分药物有一定程度的肾损害风险，使用的安全范围小[4]。近年来中医药治疗尿酸性肾病已取得显著疗效，中药不但能控制病情进展，且具有副作用小、增效减毒的优势。复方芪苓配方颗粒由黄芪、土茯苓等组方而成，具有健脾益肾、化瘀泄浊的功能。本课题组前期已初步证实其具有降低血清尿酸的作用[5]。本文基于前期工作，重点研究其对尿酸性肾病大鼠肾功能水平、肝脏黄嘌呤氧化酶活性，以及肾脏尿酸盐转运体方面的影响，为临床治疗尿酸性肾病提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 由浙江中医药大学动物实验中心提供的健康清洁级SD 雄性大鼠60 只[动物生产许可证号:SCXK（沪）2013-0016，动物质量合格证号:2008001654872]，8 周龄，体质量±150g，饲以标准颗粒饲料，自由饮水。通风条件由自动换气系统进行，通风频率8～15 次/h，灯光照明12h/天，温度22～26℃，湿度50%～60%[动物实验设施使用许可证号:SYXK（浙）2013-0184]。本实验通过实验动物伦理审批（动物管理及福利伦理审查决议书号:ZSLL-2015-141）。

1.2 主要试剂 尿酸、肌酐、尿素测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号160651、160322、160617）；黄嘌呤氧化酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20170322）；一抗购自北京中杉生物技术有限公司，兔抗大鼠URAT1 多克隆抗体（批号bs-0605R）；兔抗大鼠OAT1 多克隆抗体（批号bs-0600R）；兔抗大鼠OCT2 多克隆抗体（批号bs-1066R）；二抗购自杭州嘉朗生物技术有限公司（批号GC600705）；腺嘌呤（美国Sigma 公司，批号73-26-5，用灭菌注射用水配成浓度为4mg/mL 混悬液）；氧嗪酸钾（日本TCI 公司，批号2209-75-3，规格:BR，98%，用灭菌注射用水配成浓度为25mg/mL 注射液）；别嘌醇片（上海信谊万象药业股份有限公司，批号H31020334，规格:100mg/片，用灭菌注射用水配成浓度为0.525mg/mL 混悬液）。

1.3 复方芪苓配方颗粒配制 山慈菇6g，桑寄生15g，土茯苓、薏苡仁各30g，秦艽12g，丹参、黄芪各15g，所需中药饮片均购自浙江中医药大学中药饮片厂，并由杭州市中医院制剂室制成颗粒剂后分别配成含生药量0.12、0.24、0.48g/mL 的溶液，低温保存备用[6]。

2 实验方法

2.1 分组与造模 大鼠适应性饲养1 周后，按随机数字表法分成正常对照组、模型对照组、复方芪苓配方颗粒高、中、低剂量组及别嘌醇组，每组10 只。正常对照组给予普通饲料，并每天给予25mL/kg 蒸馏水灌胃、4mL/kg 无菌注射用水腹部皮下注射，其余5组以10%的酵母粉饲料饲喂，并每天给予0.1g/kg 腺嘌呤灌胃、0.1g/kg 氧嗪酸钾盐腹部皮下注射，连续造模2 周。实验第14 天禁食8h 后在模型对照组中随机取2 只大鼠处死取肾脏组织，进行HE 染色，观察肾脏组织病理提示有尿酸盐结晶沉着于肾小管和肾间质，提示造模成功。各组大鼠在造模后同时分别每天灌胃给药，其中复方芪苓配方颗粒高剂量组为9.6g/kg、中剂量组为4.8g/kg、低剂量组为2.4g/kg；别嘌醇组10.5mg/kg（相当于60kg 体质量成人100mg/天）；正常对照组及模型对照组给予蒸馏水20mL/kg 灌胃，连续给药2 周。

2.2 生化指标检测 末次给药次日称重后腹腔注射戊二醛麻醉，从大鼠腹主动脉采血，低温高速离心机（德国Heraeus，Biofuge Stratos） 以离心半径8cm，10000r/min 离心5min，取血清在全自动生化分析仪（日本Olympus，AU2700）上按照试剂盒说明书分别采用肌氨酸氧化酶法、尿素酶法、尿酸酶法测定各组大鼠血清肌酐、尿素、尿酸含量。然后断颈处死大鼠，在冰台上快速分取肝脏，称重后迅速与预冷的生理盐水1:9 混合，研磨匀浆后低温高速离心机（德国Sorvall，Leged RT）以离心半径14cm，8000r/min 离心10min，取上清液在分光光度计（上海第三分析仪器厂，721-100）上用化学比色法按试剂盒说明检测黄嘌呤氧化酶活性。

2.3 免疫组化法检测肾脏组织OAT1、OCT2、URAT1的表达 同时在冰台上分取肾脏组织，称重后置于10%的甲醛溶液中固定24h，常规石蜡包埋切片，然后将肾脏组织的石蜡切片脱蜡水化，经高压修复抗原后加兔抗大鼠OAT1、OCT2、URAT1 多克隆抗体，4℃孵育过夜，按二抗法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒说明孵育二抗，DBA 显色，苏木素复染。各组标本显微镜下采集5 个不重复的视野，通过Image Pro-Plus 6.0 图像分析系统进行免疫组化染色结果分析，分别统计所选视野阳性反应的光密度值，取其平均值作为各组切片的平均光密度值。

2.4 统计学方法 数据处理及统计应用SPSS 21.0统计软件，计量资料用均数±标准差（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较方差齐者用LSD 检验，方差不齐者用Games-Howell 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清肌酐、尿素、尿酸水平显著升高（P＜0.01）。与模型对照组比较，别嘌醇组及复方芪苓配方颗粒各剂量组血清肌酐、尿酸均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）；复方芪苓配方颗粒高、中剂量组血清尿素均显著降低（P＜0.01）。与别嘌醇组比较，复方芪苓配方颗粒高、中剂量组血清肌酐和尿素都有显著降低（P＜0.01），中、低剂量组血清尿酸显著高于别嘌醇组（P＜0.01），高剂量组血清尿酸无显著性差异（P＞0.05），见表1。

3.2 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的影响 与正常对照组比较，模型对照组黄嘌呤氧化酶活性显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，别嘌醇组黄嘌呤氧化酶活性显著降低（P＜0.01），复方芪苓配方颗粒高、中剂量组黄嘌呤氧化酶活性也有明显降低（P＜0.05），低剂量组黄嘌呤氧化酶活性有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。别嘌醇组黄嘌呤氧化酶活性显著低于复方芪苓配方颗粒各组（P＜0.01）。见表2。

3.3 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠肾脏OAT1、OCT2、URAT1 蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾脏组织OAT1、OCT2 表达均下调，同时URAT1 表达上调（P＜0.01）；与模型对照组比较，别嘌醇组和复方芪苓配方颗粒高剂量组OAT1 的表达显著上调（P＜0.01），别嘌醇组和复方芪苓配方颗粒高、中剂量组OCT2 的表达显著上调（P＜0.01）；复方芪苓配方颗粒高、中剂量组的大鼠肾脏URAT1 的表达较模型对照组显著下调（P＜0.01），明显优于别嘌醇组（P＜0.01），见表3。

表1 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸的影响（μmol/L，）

表1 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸的影响（μmol/L，）

注:正常对照组、模型对照组予蒸馏水20mL/kg 灌胃；别嘌醇组予别嘌醇10.5mg/kg 灌胃；复方芪苓配方颗粒高、中、低剂量组分别按9.6、4.8、2.4g/kg 灌胃；与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与别嘌醇组比较，cP＜0.01

表2 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病大鼠模型肝脏黄嘌呤氧化酶的影响（）

表2 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病大鼠模型肝脏黄嘌呤氧化酶的影响（）

注:正常对照组、模型对照组予蒸馏水20mL/kg 灌胃；别嘌醇组予别嘌醇10.5mg/kg 灌胃；复方芪苓配方颗粒高、中、低剂量组分别按9.6、4.8、2.4g/kg 灌胃；与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与别嘌醇组比较，cP＜0.01

4 讨论

尿酸性肾病是血尿酸生成过多或排泄减少导致血中尿酸盐呈过饱和状态，尿酸盐结晶沉积于肾脏而引起的肾脏损害，又称为痛风性肾病、高尿酸性肾病，严重时可发展为肾衰竭。欧洲透析移植协会资料显示尿酸性肾病占终末期肾衰竭患者的0.6%～1.0%[7]。中医对于尿酸性肾病的诊断和命名无统一标准，根据患者临床特征，归属中医“痹证”“痛风”“历节病”“淋证”“溺毒”等范畴。究其病因病机为先天脾肾虚损，气化失司，升降失职，清浊不分，体内代谢废物蓄积，酿生湿、浊、痰、瘀为患；又或后天饮食不节，过食肥甘厚味，日久伤脾，脾失健运，肾失蒸腾，气化失司，痰湿内生，出现湿瘀蕴阻之证，日久不愈，流于下焦，病损及肾，浊毒内停，发为该病。《类证治裁·痹症》对于痹症日久不愈提到“必有湿痰败血瘀滞经络”，故痰浊瘀滞脉中是引起尿酸性肾病的重要因素。该病属本虚标实之证，治疗当宜健脾益肾、化瘀泄浊、清热利湿，标本兼顾。复方芪苓配方颗粒在我院应用多年疗效良好，方中土茯苓解毒除湿，通利关节，有明显的降尿酸作用；黄芪健脾补中，升阳举陷，益卫固表，利尿[8]。山慈菇清热解毒、消痈散结，其所含秋水仙碱对急性痛风性关节炎有治疗作用；秦艽清热祛风通络，有促进尿酸排泄作用；薏苡仁健脾利湿、除痹清热；丹参可活血化瘀通络、促进组织修复和再生；桑寄生既有滋补脾肾作用，又有利湿降浊化痰之功，补中有通，寓通于补，防上述祛湿化瘀药攻伐太过；诸药相伍，集健脾益肾，利湿通络化瘀于一身，使浊毒得以泄化[9-11]。

目前国内外学者对于高尿酸血症、尿酸性肾病的研究主要有通过抑制肝脏黄嘌呤氧化酶的活性减少尿酸生成，及通过调控肾脏尿酸盐转运体增加尿酸排泄两方面[12]。尿酸合成依赖于相关的酶，而黄嘌呤氧化酶是其中重要的酶之一，直接调控体内尿酸水平的高低。别嘌醇作为黄嘌呤氧化酶抑制剂，目前仍是临床高尿酸血症治疗的一线药物，但存在较多严重的不良反应。近年来研制的非布司他也属于黄嘌呤氧化酶抑制剂，疗效优于别嘌醇，但不建议应用于尿酸盐较高的患者，且非布司他对于严重肾功能不全患者的安全性尚未进行充分评价。本研究结果表明，复方芪苓配方颗粒可以显著降低尿酸性肾病大鼠血清肌酐、尿素、尿酸水平（P＜0.05 或P＜0.01），证实其可改善肾功能，对肾脏具有一定的保护作用。此外，复方芪苓配方颗粒高、中剂量组可在一定程度上抑制尿酸性肾病模型大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性，然而与别嘌醇组比较存在显著性差异，推测其除抑制肝脏黄嘌呤氧化酶活性之外，还存在其他降尿酸机制。

研究表明，人体内约70%的尿酸盐通过肾脏排泄[13]。近年研究发现，肾脏中存在多种与尿酸盐转运相关的转运蛋白参与尿酸排泄[14]。尿酸盐是主要在肾小管中通过OAT1 转运的一种内源性有机阴离子，研究表明，下调肾脏OAT1 的表达可以使肾脏产生炎症，使肾脏有机阴离子的分泌减少[15]。OCT2 主要分布在肾脏近曲小管，介导多种有机阳离子的吸收与重吸收[16]。有研究表明，上调OCT2 可有助于抗高尿酸血症且对高尿酸血症合并肾功能不全有肾脏保护作用[17]。Hosoyamada 等[18]通过对小鼠敲除URAT1基因的研究显示，其尿中尿酸/肌酐浓度比显著高于正常小鼠，表明肾脏对尿酸的重吸收减弱。本研究结果表明，复方芪苓配方颗粒高剂量组能显著升高大鼠肾脏OAT1、OCT2 蛋白的表达，且复方芪苓配方颗粒高、中剂量组可显著降低大鼠肾脏URAT1 蛋白的表达，因此推断其降尿酸的作用机制还可能与调节尿酸性肾病模型大鼠肾脏OAT1、OCT2 及URAT1 蛋白的表达水平相关。

表3 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠肾脏组织OAT1、OCT2、URAT1 蛋白表达的影响（）

表3 复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠肾脏组织OAT1、OCT2、URAT1 蛋白表达的影响（）

注:正常对照组、模型对照组予蒸馏水20mL/kg 灌胃；别嘌醇组予别嘌醇10.5mg/kg 灌胃；复方芪苓配方颗粒高、中、低剂量组分别按9.6、4.8、2.4g/kg 灌胃；OAT1 为有机阴离子转运体1；OCT2 为有机阳离子转运体2；URAT1 为尿酸盐转运体1；与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.01；与别嘌醇组比较，cP＜0.01

综上所述，复方芪苓配方颗粒能显著降低尿酸性肾病模型大鼠的血清肌酐、尿素、尿酸水平，抑制肝脏黄嘌呤氧化酶活性，上调其肾脏OAT1、OCT2 及下调URAT1 蛋白表达，提示其具有明显的降尿酸功效，且对肾功能有一定的保护作用。其降尿酸的作用机制可能与通过抑制黄嘌呤氧化酶活性减少尿酸合成，并通过调节肾脏尿酸盐相关转运体的表达增加肾脏尿酸盐的分泌、降低肾脏对尿酸盐的重吸收能力从而增加尿酸排泄有关。