鼠尾草酚对脓毒症模型大鼠肺损伤保护作用及TRPM6、TRPM7 表达的影响

管佳宁 徐盈盈 徐君卿

流行病学研究显示，在非冠状动脉重症监护室，脓毒症是导致危重患者死亡的主要因素[1]。脓毒症可导致急性肺损伤（ALI），甚至发生急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[2]。ALI 的病理表现为肺泡毛细血管膜通透性增加、中性粒细胞向肺的无限制浸润、严重肺水肿和弥漫性肺泡损伤[3]。尽管对脓毒症诱导的ALI 相关机制的研究取得显著进展，但目前肺保护性通气是唯一有效干预治疗方法，能够降低ALI 发病时的死亡率[4]。研究显示，ARDS 患者俯卧位可以潜在地改善氧合，减少肺损伤[5]。住院前使用抗血小板治疗，可以降低ALI 发生率[6]。鼠尾草酚是迷迭香属植物的主要有效成份，具有抗炎、抗氧化、抗增殖和抗纤维化的特性。研究显示，鼠尾草酚能改善脂多糖（LPS）导致的肺损伤和肺微循环障碍，但具体机制尚不完全清楚[7]。有证据表明，转化受体电位阳离子通道亚家族M 成员6（TRPM6）和TRPM7 通道激酶基因是重要的调节因子，能够调节多种身体疾病的发展进程[8]。因此，本研究观察鼠尾草酚对脓毒症模型大鼠TRPM6 和TRPM7 表达的影响，探讨脓毒症诱导的肺损伤的保护作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 选用健康SPF 级成年雄性SD 大鼠50 只，7～8 周龄，体质量220～250g，购自浙江大学实验动物中心，实验动物生产许可证号:SCXK（浙）2018-0009，实验动物使用许可证号:SYXK（浙）2018-0014，质量合格证号:201811036。动物饲养在SPF 环境中自由进食和饮水，控制饲养环境昼夜循环（12h/12h），动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求，适应性喂养1 周后进行实验。本研究经浙江省台州市中心医院伦理委员会审核，审批号:（2018）伦审（279）号。

1.2 实验药物 鼠尾草酚（美国开曼化学公司，纯度:99.9%，批号89800），用生理盐水配置成0.5、1.0、2.0mg/mL 混悬液备用；LPS（美国Sigma 公司，批号P0789-10ML），用生理盐水配置成1mg/mL 混悬液备用。

1.3 主要试剂及仪器 苏木素染色液、BCA 蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，批号C0107、P0033）；髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建城生物工程有限公司，批号A003-1-4、A004-1-3）；白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司，批号MM-0670R22、MM-0670R95）；Trizol Reagent RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号DP421）；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反转录试剂盒、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit 荧光定量PCR 试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号RR047A、TK08045）；组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备（德国Leica 公司）；MB-3100-B 型血气分析仪（上海涵飞医疗器械有限公司）；HBS-1096B 酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪（美国Thermo 公司）；7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

2 实验方法

2.1 分组及造模 用随机数字表法将50 只大鼠分为对照组、模型组、鼠尾草酚低、中、高剂量组，每组10 只。模型组、鼠尾草酚低、中、高剂量组尾静脉给予LPS 10mg/kg（1mg/mL 混悬液，注射体积10mL/kg）制备脓毒症大鼠肺损伤模型[9]，对照组尾静脉给予生理盐水（10mL/kg）。造模1h 后鼠尾草酚低、中、高剂量组分别股静脉给予鼠尾草酚，剂量依次为5、10、20mg/kg（0.5、1.0、2.0mg/mL 混悬液，注射体积10mL/kg），对照组和模型组分别股静脉给予生理盐水（10mL/kg），24h 后麻醉大鼠，股动脉取血，用血气分析仪检测氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2）的水平，计算动脉血氧分压/吸入气氧浓度（PaO2/FiO2）的比值，麻醉处死大鼠后分离肺组织进行相关检测。

2.2 肺组织病理学检查 每组取5 只大鼠右肺上叶进行福尔马林固定，经脱水、包埋、切片（3μm），进行苏木精-伊红(HE)染色，用光学显微镜观察肺组织学变化。

2.3 肺湿重/干重（W/D）比计算 每组取5 只大鼠分离左肺上叶，用滤纸吸弃肺组织表面水分，称湿重(W)，用恒温干烤箱于70℃烤至恒重，称取余重即为干重（D），计算W/D 比值。

2.4 肺组织MPO 和SOD 活性检测 每组取5 只大鼠取部分左肺上叶组织，用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次，按1mL/100mg 的比例加入PBS，用电动匀浆器将组织制成匀浆，4℃，12000rpm 离心20min，取上清，根据试剂盒说明书检测肺组织中MPO 和SOD活性。

2.5 支气管肺泡灌洗液蛋白、IL-6 和TNF-ɑ 含量测定 每组取5 只小鼠结扎右侧主支气管近端和气管远端，在气管结扎下端用0.3mL 预冷生理盐水进行右肺灌洗，重复3 次，回收支气管肺泡灌洗液，离心取上清，根据BCA 蛋白测定试剂盒说明书检测支气管肺泡灌洗液中蛋白含量的测定；按照ELISA 试剂盒说明书检测支气管肺泡灌洗液中IL-6 和TNF-α含量。

2.6 肺组织TRPM6 和TRPM7 mRNA 表达水平测定 每组取5 只大鼠取部分左肺上叶组织，制成匀浆，采用Trizol 法提取总RNA，并进行RNA 的浓度和纯度的测定，根据RNA 反转录试剂盒说明合成cDNA，TRPM6、TRPM7 和β-actin 引物由宝生物工程大连有限公司合成。TRPM6 上游引物为5'-CCACCAATACCCTGGAAGAA-3'，下游引物为5'-AGGAGTYGCAGCGATGTTTT-3'；TRPM7 上游引物为5'-TGGCATATGAAGCAAAGCAG-3'，下游引物为5'-CAAGGTGGACGGTATAACGA-3'；β-actin 上游引物为5'-GTTGGTTGGAGCAAACATCC-3'，下游引物为:5'-AAGCAATGCTGTCACCTYCC-3'；再根据荧光定量PCR 试剂盒说明，制备20μL 反应体系进行扩增，在CFX-96 PCR 扩增仪中进行扩增。反应条件为95℃预变性1min，95℃变性30s，58℃退火5s，共30个循环，72℃延伸5s。采集荧光，以β-actin 作为内参，采用2-ΔΔCt 法计算TRPM6 和TRPM7 mRNA的表达量。

2.7 统计学方法 应用SPSS 23.0 统计分析实验数据，计量资料采用均数±标准差（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 鼠尾草酚对大鼠PaO2、PaCO2和PaO2/FiO2的影响 与对照组比较，模型组和各鼠尾草酚剂量组大鼠PaO2和PaO2/FiO2降低，PaCO2升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各鼠尾草酚剂量组大鼠PaO2和PaO2/FiO2升高，PaCO2降低，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 鼠尾草酚对各组大鼠PaO2、PaCO2 和PaO2/FiO2影响（mmHg，）

表1 鼠尾草酚对各组大鼠PaO2、PaCO2 和PaO2/FiO2影响（mmHg，）

注:对照组和模型组均给予生理盐水；鼠尾草酚低、中、高剂量组分别给予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混悬液；PaO2 为氧分压；PaCO2 为二氧化碳分压；PaO2/FiO2 为动脉血氧分压/吸入气氧浓度；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与鼠尾草酚低剂量组比较，cP＜0.05；与鼠尾草酚中剂量组比较，dP＜0.05；1mmHg=0.133kPa

3.2 鼠尾草酚对大鼠肺组织形态学改变的影响 对照组肺泡结构清楚，无炎性细胞浸润痕迹；模型组肺间室增大，肺间质炎症细胞浸润，肺间隔发生断裂，肺毛细血管充血伴血外；各鼠尾草酚剂量组肺损伤程度较模型组明显减轻，且呈剂量依赖性。见图1。

图1 鼠尾草酚对大鼠肺组织形态学改变的影响（HE 染色×200 倍）

3.3 鼠尾草酚对大鼠肺W/D、MPO 和SOD 的影响与对照组比较，模型组和各鼠尾草酚剂量组大鼠肺W/D 和MPO 升高，SOD 降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各鼠尾草酚剂量组大鼠肺W/D和MPO 降低，SOD 升高，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3.4 鼠尾草酚对大鼠肺支气管肺泡灌洗液蛋白、IL-6 和TNF-α 含量的影响 与对照组比较，模型组和各鼠尾草酚剂量组大鼠肺支气管肺泡灌洗液中蛋白、IL-6 和TNF-α 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各鼠尾草酚剂量组大鼠肺支气管肺泡灌洗液中蛋白、IL-6 和TNF-α 含量降低，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 鼠尾草酚对大鼠肺W/D、MPO 和SOD 影响（）

表2 鼠尾草酚对大鼠肺W/D、MPO 和SOD 影响（）

注:对照组和模型组均给予生理盐水；鼠尾草酚低、中、高剂量组分别给予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混悬液；W/D 为湿重/干重；MPO 为髓过氧化物酶；SOD 为超氧化物歧化酶；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与鼠尾草酚低剂量组比较，cP＜0.05；与鼠尾草酚中剂量组比较，dP＜0.05

表3 鼠尾草酚对大鼠肺支气管肺泡灌洗液蛋白、IL-6和TNF-α 含量影响（）

表3 鼠尾草酚对大鼠肺支气管肺泡灌洗液蛋白、IL-6和TNF-α 含量影响（）

注:对照组和模型组均给予生理盐水；鼠尾草酚低、中、高剂量组分别给予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混悬液；IL-6 为白细胞介素6；TNF-α为肿瘤坏死因子α；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与鼠尾草酚低剂量组比较，cP＜0.05；与鼠尾草酚中剂量组比较，dP＜0.05

3.5 鼠尾草酚对大鼠肺组织TRPM6 和TRPM7 mRNA 表达水平的影响 与对照组比较，模型组和各鼠尾草酚剂量组大鼠肺组织TRPM6 和TRPM7 mRNA 表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各鼠尾草酚剂量组大鼠肺组织TRPM6 和TRPM7 mRNA 表达水平降低，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 鼠尾草酚对大鼠肺组织TRPM6 和TRPM7 mRNA表达水平影响（）

表4 鼠尾草酚对大鼠肺组织TRPM6 和TRPM7 mRNA表达水平影响（）

注:对照组和模型组均给予生理盐水；鼠尾草酚低、中、高剂量组分别给予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混悬液；TRPM6 为转化受体电位阳离子通道亚家族M 成员6；TRPM7 为转化受体电位阳离子通道亚家族M成员7；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与鼠尾草酚低剂量组比较，cP＜0.05；与鼠尾草酚中剂量组比较，dP＜0.05

4 讨论

PaO2/FiO2通常用于急性缺氧性呼吸衰竭的诊断，是诊断ARDS 的重要指标[10]。本研究采用LPS 法建立脓毒症大鼠肺损伤模型，结果显示，模型组的PaO2和PaO2/FiO2降低，PaCO2、蛋白含量和W/D 升高，而在注射了鼠尾草酚后上述指标发生相反的变化。说明LPS 成功建立了脓毒症大鼠肺损伤模型，而鼠尾草酚对脓毒症大鼠肺水肿具有缓解作用。然而，鼠尾草酚治疗脓毒症所致肺损伤的机制尚未明确。

氧化应激参与脓毒症的发病机制。作为一种溶酶体酶，MPO 在中性粒细胞中广泛表达，主要功能是抵御微生物感染；同时，SOD 对清除活性氧至关重要，与超氧化物的损伤反应相互竞争，保护细胞免受超氧化物毒性的侵害，反映了机体清除活性氧、防止脂质氧化损伤的能力[11-12]。本研究结果显示，与模型组组比较，注射鼠尾草酚后，MPO 活性下降，SOD 活性增加（P＜0.05）。失调性肺部炎症是肺损伤中典型特征之一，因此，本研究对各种炎症介质的作用进行了深入的评估，特别是TNF-α 和IL-6。由于促炎和抗炎特性的功能，TNF-α 和IL-6 具有激活多种疾病（例如克罗恩病，糖尿病和溃疡性结肠炎）中的炎症和自身免疫过程的能力[13]。本研究显示，与模型组组比较，注射鼠尾草酚后TNF-α 和IL-6 表达降低（P＜0.05）。

TRPM6 和TRPM7 都属于瞬时受体电位离子通道家族，这些离子通道是独特的二价阳离子通道，对镁离子（Mg2+）和钙离子（Ca2+）具有通透性[14]。研究表明，TRPM6 具有调节肾脏对Mg2+的再吸收和肠道对Mg2+的吸收的能力，而TRPM7 具有调节细胞粘附活性的作用[15]。TRPM7 和TRPM6 形成一对独特的通道。TRPM6 基因编码区发生错义突变，其特征是该蛋白的表达减少，从而降低Ca2+的吸收，也影响Mg2+的吸收，高Mg2+或低Mg2+水平会造成严重的肺部疾病[16]。本研究结果显示，抑制TRPM6 和TRPM7 活性可以减轻脓毒症大鼠肺损伤引起的炎症反应。这证实了鼠尾草酚的作用及其通过降低TRPM6 和TRPM7 的表达来减轻脓毒症诱导的肺损伤的潜力。

综上所述，鼠尾草酚通过降低TRPM6 和TRPM7 的表达，减少炎症介质分泌和增加抗氧化介质的水平，发挥脓毒症大鼠的肺损伤的保护作用。