山茱萸提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231 侵袭和转移的抑制作用及机制研究

谢静静 张金花 金剑英 金 丹 郭群依

全世界每年约有100 万名妇女罹患乳腺癌，由于该病而死亡的人数超过37 万[1-2]。雌激素可通过雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）与胰岛素样生长因子1 受体（Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）途径相互作用，继而增加增殖，降低对细胞凋亡的敏感性[3-4]。IGF-1R/丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threoninekinase，Akt）可以传输来自受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK）和G 蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor，GPCRs）的信号，这些信号可被生长因子或细胞因子激活[5-6]。尽管RTK 介导的信号转导途径重叠，IGF-1R 介导的活化Akt 特别有助于IGF-1R 的抗凋亡活性[7-8]。山茱萸提取物是属于异黄酮类，包含许多可能抑制癌变的化合物，例如蛋白酶抑制剂、植酸、异黄酮；研究表明，山茱萸提取物的抗癌作用是由某些类型的细胞凋亡介导的，低浓度的山茱萸提取物可通过上调B 细胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2），下调Bcl-2 相关的X（Bax）蛋白来促进凋亡，从而对MCF-7 细胞的增殖产生抑制作用[9-10]。本研究拟探讨山茱萸提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231 侵袭和转移的抑制作用及机制，为乳腺癌的治疗提供理论依据。

1 实验材料

1.1 材料 人乳腺癌细胞MDA-MB-231（美国典型培养物保藏中心，批号KTL-66792）。

1.2 主要药品及试剂 山茱萸提取物（陕西斯诺特生物技术有限公司，批号190123）；RPMI-1640 培养基、DMEM 培养基（美国Life Technologies 公司，批号SJB-Q017、SKB-Q008）；顺铂（德国默克公司，批号S5485）；胰蛋白酶（武汉博士德生物工程有限公司，批号20181207）；胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、无血清的Dulbecco's 改良的Eagle 培养基、硝酸纤维素膜（碧云天生物技术研究所，批号CT0507、CT0108、CT6074、CM5533）；MTT 溶液（美国Sigma-Aldrich 公司，批号MR-781）；二甲基亚砜（美国Origen Bioedical 公司，批号P60178）；transwell 迁移室（德国Greiner 公司，批号DM-0079）；基质胶（美国BD 公司，批号P0873K）；TRIzol 试剂（美国Invitrogen公司，批号IK5013）；PrimeScript RT 试剂盒、SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号RR047A、RR0584）；RIPA 缓冲液、蛋白酶、磷酸酶抑制剂、NuPAGE 转移缓冲液（美国Sigma 公司，批号SA5466、SA0977、SA3011、SA7756）；Bio-rad 蛋白质测定染料试剂、NuPAGE Bis-Tris 凝胶、MOPS 运行缓冲液、5%脱脂乳TBS-T（赛默飞世尔科技有限公司，批号XY-2024R、XY-3077D、XT-5047、XA-0067）；3%牛血清白蛋白（上海信裕生物科技有限公司，批号190201）；兔抗人IGF-1R 单克隆抗体、兔抗人Akt 单克隆抗体、鼠抗人β-肌动蛋白（德国Millipore 公司，批号MAB5328、MAB1501、MAB4019）；HRP 偶联的二抗（美国Cell Signaling 公司，批号CS1123）。

1.3 仪器 ELx800 酶标仪（美国BioTek Instuments 公司）；奥林巴斯AI09 倒置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；Nikon Eclipse TS100 显微镜（日本Nikon 公司）；ABI 7500 实时PCR 系统（美国ABI 公司）；Pierce ECL 系统（美国通用公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组 将人乳腺癌细胞MDA-MB-231 分成四组，并在补充有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中于5%CO2培养箱中培养。MDA-MB-231 细胞组:细胞浓度为5×106/mL 的人乳腺癌MDA-MB-231 细胞液在10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，培养环境为:37℃、5%CO2、2%O2、93%N2；顺铂组:人乳腺癌MDA-MB-231 细胞培养方法同人乳腺癌MDA-MB-231 细胞组，加入顺铂，使顺铂最终为100.0μg/mL（预试验求出顺铂对乳腺癌细胞MDA-MB-231 的LC50 为200.0μg/mL，以1/2 LC50 为作用剂量）；山茱萸提取物低、高剂量组的人乳腺癌MDA-MB-231 细胞培养方法同前人乳腺癌MDA-MB-231 细胞组，各组分别加入山茱萸提取物，使山茱萸提取物最终为100.0、200.0μg/mL（预试验求出山茱萸提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231的LC50 为400.0μg/mL，以1/2 LC50 为高剂量水平，2 倍间距依次为低剂量水平）。以上各组每孔设6 个平行样，培养72h。

2.2 细胞活力及单克隆数目测定 为了进行细胞增殖测定，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化，以1000 个细胞/孔的密度接种到96 孔板中，最终体积为100μL，并保持在补充有10%FBS 的DMEM 培养基中，将10μL MTT 溶液加入并将细胞在37°C 下再孵育4h。将蓝色的甲基蓝晶体溶于100μL 二甲基亚砜中，并使用ELx800 酶标仪在490nm 处测量吸光度（OD 值）。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）。

用不同浓度的山茱萸提取物处理细胞72h 后，将细胞接种在6 孔板（500 个细胞/孔）中，每2～3 天用新鲜培养基更换。两周后，弃去上清液，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）小心洗涤细胞。随后，将细胞用4%多聚甲醛固定15min（室温下），然后在结晶紫中染色20min（室温下）。通过数码相机捕获菌落的图像。

2.3 细胞迁移测定 使用刮擦伤口愈合试验测定，将细胞以每孔2.5×105个细胞的量接种在6 孔板中，并在2 天之内生长至汇合以形成单层，并在实验前1天使血清饥饿。用200μL 移液器钝头在每个孔中进行一次刮擦，并将细胞培养基更改为1%FBS。在16h固定，并使用奥林巴斯AI09 倒置光学显微镜以×10放大倍数获取图像。

2.4 细胞侵袭测定 使用transwell 迁移室进行细胞侵袭测定，将5×103细胞接种在涂有12.5μg 减少生长因子的基质胶的8μm 多孔Transwell 插入片段的上腔中，在无血清的Dulbecco's 改良的Eagle 培养基中孵育。孵育后，将细胞用甲醇固定10min，并用2%结晶紫染色。用棉签将未迁移的细胞从transwell 小室中移出。使用倒置的Nikon Eclipse TS100 显微镜对染色的Transwell 膜成像。

2.5 细胞IGF-1R、Akt 基因表达测定 按照制造商的规程，使用TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA。使用PrimeScript RT 试剂盒将1μg 总RNA 逆转录。逆转录反应后，按照制造商的操作规程，将1μL 互补DNA 用于随后的qPCR 反应，所使用的试剂为SYBR Premix Ex Taq，使用的仪器为ABI 7500 实时PCR系统。本试验所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下:IGF-1R 正向:5'-GGAGTTGTATTTGCCATCACCAGGG-3'，反向:5'-ATGCGCGGGCAAATTTGATCCCATA-3'；Akt 正向:5'-ACAAGCCACAAGATTACAAGAAACGG-3'，反向:5'-CCACCAGAGTGAAAAGAACGATAGCT -3'；GAPDH 正向:5'-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3'，反向:5'-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3'。PCR 循环参数（30个循环）如下:预变性（95°C，5min），变性（95°C，30s），退火（55°C，30s）和延伸（72°C，60s）。GAPDH 用作内部对照。使用2-ΔΔCT 方法计算表达水平，并将其标准化为看家GAPDH 基因的表达水平。

2.6 细胞IGF-1R、Akt 蛋白表达测定 根据试剂盒说明，用改良的RIPA 缓冲液裂解细胞，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。离心细胞（13000rpm，10min，4℃），Bio-rad 蛋白质测定染料试剂测量蛋白质浓度。将蛋白质样品（10μg）装入NuPAGE Bis-Tris 凝胶中，并使用MOPS 运行缓冲液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（80～120V，2h）。使用NuPAGE 转移缓冲液将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，用3%牛血清白蛋白封闭转移膜1h。所有第一抗体为:兔抗人IGF-1R单克隆抗体、兔抗人Akt 单克隆抗体、鼠抗人β-肌动蛋白，在4℃下与膜孵育过夜。使用5%脱脂乳TBS-T 将HRP 偶联的二抗抗体孵育1h。PBS 液洗涤3 次后，根据制造商的说明使用Pierce ECL 系统进行检测信号。

2.7 统计学方法 采用SPSS 23.0 对数据进行录入、统计学分析。计量资料以均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析比较，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞OD 值、存活率比较 与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组MDA-MB-231 细胞OD 值、存活率降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组OD 值、存活率升高（P＜0.05），山茱萸提取物高剂量组OD 值、存活率降低（P＜0.05）；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组OD值、存活率降低（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞增殖水平比较（结晶紫染色，×400）

表1 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞OD 值、存活率比较（）

表1 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞OD 值、存活率比较（）

注:顺铂组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 顺铂；山茱萸提取物低剂量组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高剂量组为MDA-MB-231 细胞组+200.0μg/mL 山茱萸提取物；与MDA-MB-231 细胞组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05；与山茱萸提取物低剂量组比较，cP＜0.05

3.2 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞克隆形成数目比较 与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组克隆形成数目降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组克隆形成数目升高（P＜0.05），山茱萸提取物高剂量组克隆形成数目降低（P＜0.05）；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组克隆形成数目降低（P＜0.05）。见表2、图2。

图2 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞克隆形成数目比较（结晶紫染色，×200）

表2 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞克隆形成数目比较（个，）

表2 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞克隆形成数目比较（个，）

注:顺铂组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 顺铂；山茱萸提取物低剂量组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高剂量组为MDA-MB-231 细胞组+200.0μg/mL 山茱萸提取物；与MDA-MB-231 细胞组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05；与山茱萸提取物低剂量组比较，cP＜0.05

3.3 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移能力比较与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组迁移率降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组迁移率升高（P＜0.05），山茱萸提取物高剂量组迁移率降低（P＜0.05）；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组迁移率降低（P＜0.05）。见表3、图3。

图3 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移比较（×10）

3.4 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞侵袭能力比较与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组穿膜数降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组穿膜数升高（P＜0.05），山茱萸提取物高剂量组穿膜数降低（P＜0.05）；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组穿膜数降低（P＜0.05）。见表4、图4。

表3 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移能力比较（%，）

表3 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移能力比较（%，）

注:顺铂组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 顺铂；山茱萸提取物低剂量组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高剂量组为MDA-MB-231 细胞组+200.0μg/mL 山茱萸提取物；与MDA-MB-231 细胞组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05；与山茱萸提取物低剂量组比较，cP＜0.05

图4 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞穿膜数数目比较（结晶紫染色，×400）

表4 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞侵袭能力比较（个，）

表4 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞侵袭能力比较（个，）

注:顺铂组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 顺铂；山茱萸提取物低剂量组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高剂量组为MDA-MB-231 细胞组+200.0μg/mL 山茱萸提取物；与MDA-MB-231 细胞组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05；与山茱萸提取物低剂量组比较，cP＜0.05

3.5 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt mRNA 表达 与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组IGF-1R、Akt mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组IGF-1R、Akt mRNA 表达水平升高（P＜0.05），山茱萸提取物高剂量组IGF-1R、Akt mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组IGF-1R、Akt mRNA表达水平降低（P＜0.05）。见表5。

3.6 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt蛋白表达 与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组IGF-1R、Akt 蛋白表达降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组IGF-1R、Akt 蛋白表达升高（P＜0.05），山茱萸提取物高剂量组IGF-1R、Akt 蛋白表达降低（P＜0.05）；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组IGF-1R、Akt 蛋白表达降低（P＜0.05）。见表6、图5。

图5 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt 蛋白表达的比较

4 讨论

山茱萸提取物对多种类型的实体瘤具有显著的抗癌活性，尤其是对转移性乳腺癌和难治性卵巢癌的抗癌活性[11]。研究表明，高浓度的山茱萸提取物诱导人肝癌细胞G1 和G2/M 期的细胞周期停滞。此外高浓度的乳腺癌细胞会降低细胞周期蛋白D1 的表达[12]。本研究结果显示，与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组OD 值、存活率、单克隆形成数目、迁移率、穿膜数降低；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组OD 值、存活率、单克隆形成数目、迁移率、穿膜数升高，山茱萸提取物高剂量组OD 值、存活率、单克隆形成数目、迁移率、穿膜数降低；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组OD 值、存活率、单克隆形成数目、迁移率、穿膜数降低。这与上述讨论一致，同时说明山茱萸提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231 增殖、侵袭、转移具有明显抑制作用，200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤为明显。

表5 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt mRNA表达比较（）

表5 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt mRNA表达比较（）

注:顺铂组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 顺铂；山茱萸提取物低剂量组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高剂量组为MDA-MB-231 细胞组+200.0μg/mL 山茱萸提取物；IGF-1R 为胰岛素样生长因子1 受体；Akt 为丝氨酸/苏氨酸激酶；与MDA-MB-231 细胞组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05；与山茱萸提取物低剂量组比较，cP＜0.05

表6 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt 蛋白表达比较（）

表6 各组乳腺癌MDA-MB-231 细胞IGF-1R、Akt 蛋白表达比较（）

注:顺铂组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 顺铂；山茱萸提取物低剂量组为MDA-MB-231 细胞组+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高剂量组为MDA-MB-231 细胞组+200.0μg/mL 山茱萸提取物；IGF-1R:胰岛素样生长因子1 受体；Akt:丝氨酸/苏氨酸激酶；与MDA-MB-231 细胞组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05；与山茱萸提取物低剂量组比较，cP＜0.05

IGF-1R 在各种癌症的细胞生长、分化和进展中起着关键作用。据报道，IGF-1R 在许多人类癌症中都过表达，包括乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，IGF-1R（IGF-1R 的一种配体）的高循环水平与多种类型癌症的风险增加有关，这主要取决于IGF-1/IGF-1R 下游信号的激活[13-14]。在被IGF-1 激活后，IGF-1R 的酪氨酸激酶活性使下游底物磷酸化，进而导致其下游信号通路的激活，包括磷脂酰肌醇3 激酶/RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号级联[15]。人乳腺癌中IGF-1R 的破坏导致IGF-1R 相关细胞增殖的抑制。配体诱导的IGF-1R 酪氨酸激酶结构域的磷酸化导致许多细胞质信号转导分子（包括Akt 信号级联反应）的活化[16]。Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可通过失活促凋亡蛋白来促进细胞存活。已经提出了许多通过激活Akt 信号来抑制细胞死亡的机制。因此，对IGF-1R 信号的干扰被认为是潜在的癌症治疗策略[17]。本次研究结果显示，与MDA-MB-231 细胞组比较，顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表达降低；与顺铂组比较，山茱萸提取物低剂量组IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表达升高，山茱萸提取物高剂量组IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表达降低；与山茱萸提取物低剂量组比较，山茱萸提取物高剂量组IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表达降低。这说明，山茱萸提取物的浓度越高，IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表达就越低，200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤为明显，这提示山茱萸提取物可抑制IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白的表达进而抑制IGF-1R/Akt 信号通路的激活。

综上所述，山茱萸提取物对乳腺癌细胞MDAMB-231 增殖、侵袭、转移具有明显抑制作用，200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤为明显；其机制可能与山茱萸提取物抑制IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白的表达进而抑制IGF-1R/Akt 信号通路的激活有关。