黑胸散白蚁肠道内芽孢杆菌F8产纤维素酶发酵工艺研究

冯 冲,李婼雯,夏 雪, 顿弘斌,田嘉兴

(郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044)

纤维素酶在食品、饲料、纺织、医药、造纸及洗涤剂等行业[1]有广泛应用价值，但酶用量大、成本高,在一程度上限制了其生产应用。纤维素酶在自然界的分布非常广泛，存在于微生物、某些脊椎动物，甚至是高等植物体内[2]。自然界中纤维素类物质的生物降解主要依赖于产纤维素酶的微生物来完成[3]，能产生纤维素酶的微生物主要有细菌、真菌、放线菌等。纤维素酶产生菌的自然筛选是从自然界中获得野生菌株，是菌株选育工作的最原始、最基础的方法[4-5]，也是构建菌种数据库的有效方法。本文从黑胸散白蚁肠道内筛选出来一株产纤维素酶的芽孢杆菌，命名为F8[6]，对其产酶发酵工艺和发酵条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芽孢杆菌F8菌株：来自河南农业大学农业农村部农业微生物酶工程重点实验室；种子液培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，蒸馏水1000 mL，调pH至7.0，121℃灭菌20 min；发酵产酶培养基：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，稻草秸秆粉0.5%，蒸馏水1000 mL。121℃灭菌20 min。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH=4.8)：0.1 M醋酸溶液和0.1 M醋酸钠溶液以46的体积比混合，低温冷藏备用；DNS染色试剂[7]：溶液A(分析纯NaOH 104 g，溶于1300 mL水中，加入30g分析纯3，5-二硝基水杨酸)和溶液B(分析纯酒石酸钾钠910 g，溶于2500 mL水中，加入25 g无水亚硫酸钠)混合后加入1200 mL水，暗处放置一星期后使用。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的制作

分别吸取1 mg/mL标准葡萄糖液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，依次放入15 mL比色管中，补加水至2.0 mL，加入2.0 mL DNS试剂，具塞，沸水浴中反应10 min，冷却后定容至15 mL。分光光度计550 nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法拟合y=ax+b一元线性方程，由光密度值引得葡萄糖量。

FPA和CMC酶活的测定参照文献[8-9]进行。

1.2.3 粗酶的提取

取发酵液1.5 mL，4 000 r/min离心10 min，取上清液，即得粗酶液。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线如图1，回归方程为y=1.8219x-0.053，标准曲线的线性相关系数R2=0.9994。

图1 葡萄糖标准曲线图

2.2 最佳碳源的确定

初始培养基分别以0.5%(质量百分比)玉米秸秆、稻草、微晶纤维素、麸皮、葡萄糖、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、可溶性淀粉作为碳源。接种量5%，初始pH7.5，35℃，150 r/min发酵产酶培养2 d ，测定发酵粗酶液的CMC酶活和FPA。结果显示筛选菌株F8对碳源的利用比较广泛，其中以CMC-Na为碳源时酶活力最高，CMC酶活和FPA分别是为0.032 U/mL,0.048 U/mL。因此，确定CMC-Na为最佳碳源。

2.3 最佳氮源的确定

以CMC-Na为主碳源，分别以1%(质量百分比)蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，豆粕粉，稻草，尿素，(NH4)2SO4, (NH4)2HPO4，1%蛋白胨+1%酵母粉为氮源，接种量5%，初始pH7.5，35℃，150 r/min发酵产酶培养2 d ，测定发酵粗酶液的CMC酶活和FPA。结果显示菌株F8对氮源的利用也很广泛，尤其以牛肉膏为氮源时FPA最高，为0.039 U/mL(此时CMC酶活为0.028 U/mL)；以豆粕为氮源时CMC酶活最高，为0.031 U/mL(此时FPA为0.031 U/mL)。可以看出，CMC酶活与FPA的相对最高值不能在同一氮源条件下取得。由于豆粕的成本较低，综合考虑以豆粕为最佳氮源。

2.4 最佳接种量的确定

分别以2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%及20%的接种量，将种子培养液接种于100mL产酶培养液中，初始pH7.5，36 ℃，150 r/min条件下振荡培养2 d，测定各接种量条件下粗酶液的CMC酶活和FPA，结果如图2所示。

图2 接种量对菌株产酶能力的影响

由图2可知，当接种量为6%左右时，CMC酶活与FPA都相对较高，分别达0.0162 U/mL和0.0245 U/mL。因此，确定6%为最佳接种量。

2.5 最佳装液量的确定

在300 mL三角瓶中分别装入40，60，80，100，120，140，160，180及200 mL发酵产酶培养基，接种量6%，初始pH7.5，36 ℃，150 r/min条件下培养2 d，测定各条件下粗酶液的CMC酶活和FPA，结果如图3所示。

国务院总理周恩来1974年做出批示：“天然气进京，把首都变成空气最干净，街道最清洁，环境最优美的城市。”把华北油田的天然气引进北京城，这是周总理生前愿望，也是广大石油工人的多年夙愿。

图3 装液量对菌株产酶能力的影响

由图3可知，装液量在60 mL时，CMC酶活与FPA都相对较高，分别为0.0164 U/mL和0.0208 U/mL。说明充足的氧气有利于提高菌体的酶活，其中60 mL装液量为最佳。

2.6 最佳pH的确定

按6%的接种量，将种子培养液接种于60 mL产酶发酵液中，初始发酵液的pH分别调至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。36 ℃，150 r/min条件下振荡培养2 d，使菌株发酵产酶，测定各pH时粗酶液的CMC酶活与FPA，结果如图4所示。

图4 pH对菌株产酶能力的影响

由图4可知，发酵液初始pH的变化对F8产酶活力的影响较大。pH为7.0时，CMC酶活与FPA都达最高值，分别为0.0254 U/mL和0.0183 U/mL。因此，选择pH 7.0为最佳发酵初始pH。

2.7 最佳温度的确定

按6%的接种量，将种子培养液接种于初始pH 7.0的60 mL产酶发酵液中，分别放入25，28，32，36，40℃的摇床中，150 r/min条件下振荡培养2 d，使菌株发酵产酶，测定各pH时粗酶液的CMC酶活与FPA，结果如图5所示。

图5 温度对菌株产酶能力的影响

由图5可知，培养温度对F8产纤维素酶影响较大。随着温度的上升，发酵液中酶活力也随之增加，在发酵培养温度为36℃时，菌株产CMC酶活与FPA均为最大值，分别是0.0213 U/mL和0.0224 U/mL，此后温度继续升高，酶活力反而下降。因此，36℃是发酵产纤维素酶的最佳培养温度。

2.8 最佳时间的确定

按6%的接种量，将种子培养液接种于初始pH 7.0的60 mL产酶发酵液中，放入36℃的摇床中，150 r/min条件下分别培养1～5 d，使菌株发酵产酶，分别测定不同培养时间粗酶液的CMC酶活与FPA，结果如图6所示。

图6 时间对菌株产酶能力的影响

由图6可知，随着培养时间的延长，F8菌株产酶活力也随之增大，并在2 d处CMC酶活与FPA都取得最高值，分别为0.0186 U/mL和0.0229 U/mL。因此，最佳时间确定为2 d。

2.9 正交试验设计

为研究筛选菌株F8产纤维素酶的最佳培养条件，设计正交试验验证各影响因素，对各个培养条件进行综合分析和优化。根据上述单因素的试验结果，选择七因子三水平进行正交试验，如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

由表2进行直观分析，可以看出，CMC酶活的最优组合是A2B3C1D2E1F3G1，比较各因素的极差大小为RB=RG>RA=RE>RC>RD=RF，对CMC酶活影响的主次顺序为BGAECDF；FPA的最优组合是A1B2C1D2E2F2G2，比较各因素的极差大小为RD>RA=RF=RG>RC=RE>RB，对FPA影响的主次顺序为DAFGCEB。由于两个指标单独分析出来的最优条件不一致，需要根据因素对两个指标影响的主次顺序综合考虑确定出最优组合。

综合直观分析，本试验的最优组合是A1B3C1D2E1F2G1。碳源CMC-Na浓度是0.5%，氮源浓度1.5%，装液量40 mL，pH7.0，接种量5%，温度35 ℃，时间2 d。

表2 正交试验结果

续表2

3 结论

从黑胸散白蚁肠道内筛选出来的一株产纤维素酶的芽孢杆菌F8，对其产酶发酵工艺条件进行优化。该菌株产纤维素酶的最佳条件为：羧甲基纤维素钠质量百分比为0.5%，氮源质量百分比为 1.5%，装液量40 mL/300mL，初始pH 7.0，接种量5%，温度35 ℃，时间2 d。