FoxM1通过促进肿瘤干细胞化参与骨肉瘤细胞对顺铂的耐药

郑露露，蔡永萍,2，胡 勇，鲁康洋，何桂芳，李明凤，曹立宇,2，尹 玉,2

骨肉瘤是常见的骨原发性高度恶性肿瘤，好发于青少年。自采用新辅助化疗联合手术切除综合治疗后，患者5年生存率从10%～20%提高到60%～70%，但对化疗耐药的患者预后较差，易复发和转移[1]。化疗耐药成为制约骨肉瘤疗效的瓶颈。近年研究表明，肿瘤干细胞是一群具有自我更新能力、不对称分裂的细胞亚群，与肿瘤的发生发展、转移复发和化疗耐药具有密切关系[2]。

新近研究发现，叉头转录因子1(FoxM1)不仅在促进肿瘤的发生、发展和转移中扮演重要角色，还参与肿瘤的化疗耐药[3]。Yuan等[4]报道FoxM1通过促进肿瘤干细胞的更新参与化疗耐药。本课题组前期实验发现，FoxM1通过上调DNA损伤修复蛋白表达促进骨肉瘤细胞对顺铂化疗药物的耐药[5]，但FoxM1是否通过调控肿瘤干细胞化参与顺铂的化疗耐药，目前尚未见报道。本实验主要探讨FoxM1是否促进肿瘤干细胞化参与骨肉瘤细胞对顺铂的化疗耐药，期望为逆转骨肉瘤化疗耐药提供新思路和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞库。FoxM1抗体(克隆号ab175798)购于Abcam公司。β-actin抗体(克隆号4970T)购于CST公司。Sox-2(克隆号WLA022)、Nanog(克隆号WL00982)、Oct-4(克隆号WL02020)抗体，均购于万类生物公司。HRP标记的抗兔二抗、DMSO(二甲亚砜)购于碧云天公司。bFGF、EGF、DMEM/F12、限制性内切酶购于Gibco公司。RPMI 1640培养基购于Hyclone公司。Polybrene和嘌呤霉素购于Sigma公司。Lipofectamine 2000及逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司。Thiostrepton(CAS 1393-48-2)、PLKO载体、过表达质粒PCDH载体，均购于Sigma-Aldrich公司。灭活胎牛血清(FBS)购于Biological Industries公司。非黏附性6孔板购于NEST公司。顺铂(CDP)购于南京制药厂。质粒测序由安徽通用生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 细胞在含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，每2～3天弃旧液，PBS清洗，更换新的培养液，细胞密度达80%～90%时，经0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养。

1.2.2耐药细胞系的建立 将对数生长期的MG-63细胞接种于小皿，0.1 μg/mL培养48 h后更换为无顺铂的培养液继续培养，细胞密度达80%～90%后传代，重复上述3次后药物浓度增加为0.2 μg/mL，依此递增顺铂浓度继续诱导细胞耐药，约17周后得到在2 μg/mL浓度下稳定生长和传代耐药细胞命名为MG-63R。

1.2.3慢病毒转染构建稳定过表达FoxM1细胞 FoxM1克隆引物序列如下：FoxM1正义链：5′-AGAGCTAGCGAATTCATGAAAACTAGCCCCCGTCG-3′；反义链：5′-CGCGGCCGCGGATCCGTACTGTAGC TCAGGAATAAACTGGG-3′。对FoxM1扩增产物经测序验证。将750 μL opti-MEM和60 μL Lipofectamine 2000混合物与750 μL opti-MEM、12 μg质粒(LV-NC或LV-FoxM1)、6 μg包装病毒质粒和1.5 μg VSVG的混合物，混合后室温静置20 min，将其加入293T细胞培养液中，培养6 h后更换培养基，隔天收获293T的培养基病毒上清。取2 mL，同时加入2 μL Polybrene，用于培养MG-63细胞，6 h后添加2 mL培养液，第2天更换新鲜培养液。1 μg/mL的嘌呤霉素筛选感染细胞，进行传代培养。

1.2.4MTT法 采用MTT法检测IC50值。每孔8×103个细胞，设置5个复孔。第2天，弃去培养基，每孔加入顺铂浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL，联合使用4 μmol/L Thiostrepton或单独使用顺铂。第3天，每孔中加入新鲜配置的MTT溶液，37 ℃的温度下保存4 h后弃去液体，每孔加入150 μL DMSO，紫色结晶溶解，室温摇床摇10 min，490 nm处测定吸光度。

1.2.5细胞增殖实验 每孔2×103个细胞，设置5个复孔。24 h后弃去培养基，每孔加入2 μg/mL的顺铂，联合使用4 μmol/L Thiostrepton或单独使用顺铂。第1、2、3、4和5天，每孔中加入新鲜配置的MTT溶液，37 ℃的温度下保存4 h后弃去液体，每孔加入150 μL DMSO，紫色结晶溶解，室温摇床摇10 min，490 nm处测定吸光度。

1.2.6Western blot法 提取总蛋白，采用BCA进行蛋白定量，每孔加入蛋白样品总量约80 μg进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流200 mA转膜2 h后用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP标记的抗兔二抗(1 ∶10 000稀释)孵育1 h，TBST清洗3次，显影并用Image J软件分析处理条带。一抗稀释比：FoxM1(1 ∶1 000)、Sox-2(1 ∶500)、Nanog(1 ∶500)、Oct-4(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)。

1.2.7无血清培养悬浮克隆球试验 将MG-63、MG-63F、MG-63V、MG-63R细胞接种于低黏附6孔板，每孔接种3 000个细胞，加入1 mL的含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF的DMEM/F12无血清培养基。间隔3天加入500 μL含10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF的DMEM/F12的无血清培养基。第3天加入4 μmol/L Thiostrepton。培养2周后随机选取10个不同视野用倒置显微镜计数大于直径50 μm球体。

2 结果

2.1 骨肉瘤耐药细胞和亲本细胞中FoxM1蛋白的表达运用浓度递增方法诱导筛选骨肉瘤亲本MG-63细胞，获得稳定在2 μg/mL顺铂中生长良好的耐药细胞系MG-63R。与MG-63相比，MG-63R对顺铂的抵抗性更强，其IC50由亲本细胞的1.27增加到7.36(图1A)。2 μg/mL顺铂处理后，与MG-63相比，MG-63R增殖能力明显增强(图1B)。Western blot法检测结果显示，在MG-63R细胞中FoxM1蛋白表达比MG-63细胞明显升高(图1C，P<0.05)。

2.2 利用慢病毒载体构建稳定过表达FoxM1骨肉瘤细胞MG-63F酶切及测序结果显示，慢病毒表达载体LV-FoxM1构建正确，并进行慢病毒包装转染，1 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。构建稳定过表达FoxM1的MG-63F(转染LV-FoxM1)和对照组MG-63V(转染LV-NC)。Western blot法结果显示，与对照组相比，MG-63F中FoxM1蛋白表达水平明显增高(图2A)。FoxM1特异性抑制剂4 μmol/L Thiostrepton处理后，MG-63F中FoxM1蛋白水平表达明显下降(图2B)，表明成功构建稳定过表达FoxM1骨肉瘤细胞。

图1 A.MTT法检测MG-63和MG-63R的IC50值；B.2 μg/mL顺铂处理后对MG-63和MG-63R的增殖能力影响；C.Western blot法检测MG-63和MG-63R中FoxM1蛋白表达水平

图2 A.Western blot法检测MG-63V和MG-63F细胞中FoxM1蛋白水平；B.在MG-63F细胞中，经thiostrepton处理后FoxM1蛋白的表达水平变化

2.3 骨肉瘤耐药细胞中肿瘤干细胞样特征Western blot法检测结果发现，肿瘤干细胞相关标志物Sox-2、Nanog、Oct-4蛋白在MG-63R细胞中表达较MG-63细胞明显增高(图3A)。MG-63R细胞成球能力较亲本细胞强，形成较大的非贴壁球体，悬浮克隆球平均数量22个，而MG-63细胞悬浮克隆球数量平均为14个(图3B、C，P<0.05)。结果显示，同亲本MG-63细胞相比，顺铂耐药细胞MG-63R细胞的肿瘤干细胞样特征明显增强。

图3 A.Western blot法检测耐药细胞MG-63和MG-63R中肿瘤干细胞相关标志物Sox-2、Nanog、Oct-4蛋白的表达；B、C.MG-63和MG-63R的平均悬浮克隆球数目

2.4 FoxM1过表达对骨肉瘤细胞的肿瘤干细胞样特征和顺铂耐药的影响与对照组相比，肿瘤干细胞相关标志物Sox-2、Nanog、Oct-4蛋白在MG-63F细胞中明显增强(图4A)。MG-63F细胞成球能力强，其悬浮克隆球平均数量25个，而MG-63V细胞悬浮克隆球平均数量为14个(图4B、C，P<0.05)。同时，MG-63F较对照组表现出更强的顺铂抵抗性，其IC50值由对照组0.96升高到31.23(图4D)。在顺铂处理后，与MG-63V相比，MG-63F增殖明显增强(图4E)。研究结果提示，FoxM1过表达促进骨肉瘤细胞对顺铂耐药，并且肿瘤干细胞化样特征增强。

2.5 FoxM1抑制剂对逆肿瘤干细胞化及对顺铂敏感性的影响结果显示，MG-63F中FoxM1抑制剂4 μmol/L Thiostrepton处理后，肿瘤干细胞相关标志物Sox-2、Nanog、Oct-4的蛋白水平表达明显降低(图5A)。4 μmol/L Thiostrepton处理后，MG-63F细胞悬浮克隆球数量明显降低，同时MG-63V细胞悬浮克隆球数量也明显减少(图5B、C)。4 μmol/L Thiostrepton处理后，MG-63F细胞对顺铂的耐药性降低，其IC50值由17.22降为0.62(图5D)。与单独使用2 μg/mL顺铂相比，联合使用4 μmol/L Thiostrepton和2 μg/mL顺铂处理后，MG-63F增殖能力明显降低(图5E)。以上结果表明，抑制FoxM1表达可能通过抑制骨肉瘤细胞肿瘤干细胞化逆转顺铂耐药性，从而增强其对顺铂的敏感性。

3 讨论

骨肉瘤是发生于青少年的常见骨原发性高度恶性肿瘤，新辅助化疗耐药的患者术后易复发和转移，5年生存率不足20%[6]。探索化疗耐药机制及寻找逆转靶点成为骨肉瘤患者治疗面临的一大难题[7]。目前研究发现多种因素参与化疗耐药，包括细胞膜泵药物外排能力增强、抗凋亡能力和DNA损伤修复能力增强和获得肿瘤干细胞样特征等[8]。

大量研究表明对化疗药物具有抵抗性的一群细胞具有肿瘤干细胞特征，传统的化疗药物治疗可以消灭大多数处于增殖期的肿瘤细胞，但是具有耐药性的肿瘤干细胞会再次增殖分化形成肿瘤的复发[9]。体外无血清培养基培养悬浮克隆球是常见的检测肿瘤干细胞能力形成的实验，也可用来富集肿瘤干细胞[9-10]。但目前关于骨肉瘤肿瘤干细胞亚群对化疗药物抵抗性增加的具体机制尚不清楚[2]。Basu-Roy等[11]研究发现，Sox2通过拮抗Hippo通路，促进骨肉瘤干细胞增殖和更新。也有研究发现肿瘤干细胞对化疗药物抵抗性可能与ABC转运蛋白的表达增高促进药物外排能力有关[10,12]。

最初发现FoxM1是调控细胞周期重要的转录因子，随后研究发现FoxM1也可通过调控下游AKT通路等参与传统抗肿瘤化疗药物的耐药[13]。本课题组前期实验发现，顺铂耐药骨肉瘤细胞高表达FoxM1，临床骨肉瘤组织样本中高表达FoxM1的患者生存率较低[14]，新辅助化疗耐药患者预后往往较差，推测FoxM1高表达可能与骨肉瘤化疗耐药相关。但FoxM1是否通过调控肿瘤干细胞化参与化疗耐药，目前尚不清楚。本实验结果显示，与亲本细胞相比，骨肉瘤顺铂耐药细胞中肿瘤干细胞样标志物(Sox-2、Oct-4、Nanog)表达增强，无血清培养试验显示平均悬浮克隆球数目增多。文献报道[15-16]骨肉瘤顺铂耐药细胞高表达肿瘤干细胞标志物，更容易形成悬浮球，在小鼠体内更易形成肿瘤，与本实验结果一致。稳定过表达FoxM1骨肉瘤细胞具有和顺铂耐药细胞同样的表型，包括对顺铂耐药性增强，同时肿瘤干细胞样特征明显增强，和平均悬浮克隆球数目也显著增高。由此作者推测FoxM1过表达可能通过促进肿瘤干细胞特征参与骨肉瘤顺铂耐药。与本实验结果一致，Hou等[12]报道FoxM1表达促进肿瘤干细胞特征参与鼻咽癌化疗耐药。但后续可能需要更多的其它实验如动物成瘤实验等，进一步验证FoxM1过表达的细胞具有肿瘤干细胞特征。

图4 A.Western blot法检测MG-63V和MG-63F中肿瘤干细胞相关标志物Sox-2、Nanog、Oct-4的蛋白表达水平；B、C.MG-63V和MG-63F的平均悬浮克隆球数目；D.MTT法检测MG-63V和MG-63F的IC50值；E.检测在顺铂作用下MG-63V和MG-63F的增殖能力

图5 A.Western blot法检测MG-63F中4 μmol/L Thiostrepton处理后对肿瘤干细胞相关标志物蛋白Sox-2、Nanog、Oct-4表达的影响；B、C. 4 μmol/L Thiostrepton分别处理MG-63V、MG-63F细胞后其相应平均悬浮克隆球数目变化；D.MTT法检测MG-63F中4 μmol/L Thiostrepton处理后IC50的值；E.4 μmol/L Thiostrepton处理后MG-63F增殖能力变化

本实验发现，FoxM1抑制剂Thiostrepton处理后，能够显著逆转稳定过表达FoxM1骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性，推测抑制FoxM1表达可能通过逆转骨肉瘤细胞的肿瘤干细胞化表型，增加骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。但FoxM1促进骨肉瘤干细胞表达的具体机制目前尚不清楚，仍需进一步研究，深入探讨其发生的分子机制。Yuan等[4]研究发现在前列腺癌中，FoxM1通过与泛素样含PHD蛋白和环指域蛋白(UHRF1)基因的FKH motifs区域结合促进肿瘤干细胞更新和紫杉烷的耐药性。最近报道发现FoxM1通过下调DNA双链损伤介导修复途径促进鼻咽癌对顺铂的化疗耐药[17]，也有研究显示FoxM1高表达通过上调ABCC10促进药物外排参与结直肠癌对5-FU的耐药[10]。以上研究表明，FoxM1除了通过促进肿瘤干细胞化促进化疗耐药，还可能通过促进DNA损伤修复、增加药物外排能力等机制促进肿瘤细胞的化疗耐药。

综上所述，本实验发现FoxM1过表达可能通过促进肿瘤干细胞化参与骨肉瘤对顺铂耐药，抑制FoxM1表达增加骨肉瘤细胞耐药细胞对顺铂的敏感性，推测FoxM1可能成为骨肉瘤顺铂化疗耐药治疗的新靶点。