孕激素对不同PGRMC2表达的卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响及发生机制

傅 优，郑 洪，黄佳佳，陶贵珠

用的孕激素受体膜成分(progesterone receptor membrane components,PGRMCs)的表达和功能上[4]。孕激素受体膜成分2(progesterone receptor membrane component 2, PGRMC2)是PGRMCs中的一员。Albrecht等[5]的实验结果显示，在卵巢癌SKOV3细胞中PGRMC2的高表达可抑制其迁移，而降低PGRMC2表达水平可促进其迁移。Jühlen等[6]提出PGRMC2的抑制肿瘤转移作用可能由孕激素介导。另外，研究发现卵巢癌在发生、发展过程中存在Wnt信号通路的异常激活，其中Wnt信号通路相关蛋白β-catenin表达明显升高[7]。Wnt/β-catenin信号通路的激活促进了癌细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程，从而增强了肿瘤的转移能力[8]。但是，在卵巢癌中孕激素是否通过PGRMC2介导影响卵巢癌的迁移和侵袭及其与Wnt信号通路的关系尚未见报道。因此，本实验通过不同浓度孕激素作用于卵巢癌细胞，探讨其对卵巢癌迁移、侵袭的影响及可能机制，为开发有效的卵巢癌治疗策略和控制其转移的靶标提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢浆液性囊腺癌SKOV3、HO-8910细胞系分别购于南京凯基生物公司、江苏齐氏生物公司；BI胎牛血清购于以色列Biological Industries公司；孕激素购于中国Med Chem Express公司；CCK-8试剂盒购于上海Beyotime公司；Transwell小室购于Costar公司；Matrigel基质胶购于BD Biocoat；PGRMC2单克隆抗体购于Santa Cruz公司，鼠抗人内参GAPDH一抗购于上海Beyotime公司，β-catenin单克隆抗体购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及处理 人卵巢癌SKOV3、HO-8910细胞均在含10%胎牛血清、10 000 μ/mL青霉素、10 000 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5%CO2相对饱和湿度条件中培养。待细胞生长融合度达80%左右进行消化、传代。

1.2.2CCK-8法 采用CCK-8法测定孕激素对卵巢癌细胞存活率的影响。取对数生长期的SKOV3、HO-8910细胞，以每孔5×103个接种于96孔板中，37 ℃、5%CO2相对饱和湿度条件中培养。待细胞生长融合度达70%～80%，加入不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，每组设3个复孔，同时设置空白组和对照组。作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培养箱中孵育2～3 h，用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的光密度(OD)值。

1.2.3Transwell迁移实验 于小室板下室中加入550 μL的10%含血清培养基，上室(不含基质胶)加入100 μL无血清的细胞悬液(浓度为每毫升5×104个细胞)及不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，各个药物浓度均由无血清培养基稀释而成。每个药物浓度做3个复孔，并设置对照组(100 μL无血清培养基与100 μL的细胞悬液吹打混匀加入Transwell上室)，放入37 ℃、5%CO2的培养箱孵育48 h。取出小室板进行固定染色，中性树胶封固，倒置显微镜下观察并拍照，每张载玻片随机拍取5个视野，记下每个视野的细胞数并取均值记为一次实验结果，实验重复3次，并进行统计学分析。

1.2.4Transwell侵袭实验 除于小室板上室包被、水化基质胶外，其余步骤均与Transwell迁移实验相同。

1.2.5Western blot法 取对数生长期的细胞，待细胞长至培养瓶的80%后分别加入同等体积、不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，并设置对照组。作用48 h后将细胞取出加入裂解液提取蛋白，通过BCA法进行蛋白定量。配胶、上样、电泳、切胶及电转，于5%脱脂奶粉中封闭2 h，加入一抗PGRMC2(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶7 500)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗孵育2 h，TBST充分洗膜。采用ECL化学发光法曝光显影。

2 结果

2.1 不同浓度孕激素作用卵巢癌细胞SKOV3及HO-8910后对细胞增殖的影响应用CCK-8法检测不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素分别作用SKOV3、HO-8910细胞24、48、72 h后观察细胞的增殖情况。结果显示，孕激素可抑制卵巢癌细胞的增殖，呈浓度-时间依赖性下降，且对HO-8910细胞抑制增殖的作用较SKOV3细胞明显(P<0.05，图1)。同一时间不同浓度(10、20、40 μmol/L)孕激素处理SKOV3、HO-8910细胞后，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，各实验组间存活率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(除外孕激素浓度为10、20 μmol/L作用SKOV3细胞24 h)。同一浓度不同时间(24、48、72 h)孕激素处理SKOV3、HO-8910细胞后，结果显示随着药物作用时间的延长，孕激素对细胞增殖的抑制作用增强，各实验组间差异均有统计学意义(P<0.05)(除外10 μmol/L孕激素作用SKOV3细胞24～48 h、作用HO-8910细胞48～72 h)。孕激素作用48 h后，可明显抑制两组细胞株的增殖，且两株细胞间细胞存活率相比，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，采用作用时间为48 h的孕激素用于后续实验。

2.2 不同浓度孕激素作用卵巢癌细胞SKOV3及HO-8910后对细胞迁移及侵袭的影响应用Transwell法检测不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素作用SKOV3、HO-8910细胞48 h后细胞的迁移及侵袭能力。结果显示，SKOV3、HO-8910细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数量对照组明显高于实验组(P<0.05)(图2A、B)。同种细胞，癌细胞的迁移能力随着孕激素浓度的升高而减弱，呈剂量依赖性，各组差异有统计学意义(P<0.05)(除外孕激素浓度为10～20 μmol/L)。相同的药物作用时间及浓度，SKOV3穿过小室的细胞数量与HO-8910相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。这一结果表明，孕激素可抑制SKOV3、HO-8910细胞的迁移和侵袭。

图1 CCK-8法检测不同浓度孕激素对卵巢癌SKOV3(A)、HO-8910(B)细胞增殖的影响

2.3 Western blot法检测不同浓度孕激素作用卵巢癌细胞SKOV3及HO-8910后对细胞中PGRMC2和β-catenin蛋白表达的影响运用不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素作用SKOV3、HO-8910细胞48 h后，Western blot结果显示，SKOV3及HO-8910细胞实验组PGRMC2蛋白表达水平与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。HO-8910细胞的对照组及实验组PGRMC2蛋白相对表达量较SKOV3高，差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3及HO-8910细胞实验组β-catenin蛋白表达水平与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。随着孕激素浓度的增加，β-catenin的表达降低，各组间差异有统计学意义(P<0.05)(除外孕激素浓度为10～20 μmol/L)，且SKOV3细胞的对照组及实验组β-catenin蛋白表达水平较HO-8910高，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，孕激素对PGRMC2蛋白表达无影响，但可下调β-catenin蛋白的表达水平，且随着孕激素浓度的增加，这种下调作用更加明显。

图2 Transwell实验检测不同浓度孕激素对卵巢癌SKOV3、HO-8910细胞迁移(A)和侵袭(B)能力的影响与同种细胞株中对照组相比，*P<0.05；与同种细胞株中浓度10、20 μmol/L相比，#P<0.05

图3 Western blot法检测不同浓度孕激素作用卵巢癌细胞SKOV3及HO-8910后细胞中PGRMC2和β-catenin蛋白的表达水平

与同种细胞株中对照组相比，*P<0.05；与同种细胞株中浓度10、20 μmol/L相比，#P<0.05

3 讨论

由于卵巢癌早期缺乏有效的诊疗方法，常于转移阶段被诊断出来。转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。大量流行病学调查发现女性口服避孕药和妊娠可降低卵巢癌的发病率，常规服用含孕激素的口服避孕药可降低30%的卵巢癌风险[9]。但孕激素对卵巢癌保护作用的分子机制至今尚不清楚。

近年来有研究显示[10]，孕激素可通过降低ADP-核糖基化因子6(ARF6)、神经前体细胞表达的发育性下调基因9(NEDD9)及膜型1基质金属蛋白酶(MT1-MMP)3种蛋白的表达来调节侵入性伪足(invadopodia)的形成，最终抑制子宫内膜癌的迁移和侵袭。另有研究认为[11]孕激素可通过抑制TGF-β/SMAD信号传导途径来减弱子宫内膜癌的转移和侵袭。众所周知，TGF-β可调节肿瘤细胞的转移能力，部分原因是其可促进EMT[12]。TGF-β通过SMAD2/3的直接磷酸化，活性SMAD复合物的核转位以及随后与其他转录因子的相互作用来触发EMT。Bokhari等[11]研究显示，孕激素通过上调E-cadherin和下调vimentin的表达来抑制EMT，最终降低子宫内膜癌的迁移、侵袭能力。这与Jeon等[13]提出的观点一致，认为孕激素通过改变EMT相关标志物的表达来抑制肿瘤细胞的转移。以上研究均提示了孕激素可能会抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭，但孕激素是否影响卵巢癌细胞的迁移、侵袭及其机制鲜有报道。

本实验通过不同浓度的孕激素作用于卵巢癌SKOV3、HO-8910细胞，观察其对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。CCK-8结果显示，孕激素(10～40 μmol/L)作用24、48、72 h后均可抑制两株细胞的增殖。综合两株细胞的增殖情况，实验采用作用时间为48 h的孕激素用于后续实验。Transwell迁移、侵袭实验显示，孕激素作用后的细胞迁移能力较对照组明显降低，且随着孕激素浓度的增加，同种细胞的迁移、侵袭能力降低，呈剂量依赖性。这提示孕激素可抑制卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力，但其影响卵巢癌迁移、侵袭能力的相关分子机制尚不清楚。

EMT是恶性肿瘤转移的重要阶段，其中上皮细胞失去细胞内黏附和细胞极性，并增强其运动性和侵入性，成为间充质细胞。EMT过程调节多种蛋白的表达，如增加间充质标志物vimentin的表达，减少上皮标志物E-cadherin的表达。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活已被指出参与多种肿瘤的发生[7]。该通路的激活促进了癌细胞中EMT的过程，为肿瘤提供了更强的生存和转移能力[14]。β-catenin是Wnt信号通路中的关键蛋白。在Wnt信号存在和E-cadherin缺失的情况下，β-catenin在胞质中的积累，随后是胞核中的易位和活化，并激活EMT促进因子的表达，癌细胞之间的黏附性降低，这是肿瘤转移的关键[15-16]。Bokhari等[11]提出孕激素可抑制EMT从而影响子宫内膜癌的迁移及侵袭。因此，作者推测孕激素是否通过抑制Wnt信号通路来影响卵巢癌细胞的迁移及侵袭。本实验中运用Western blot法检测不同浓度孕激素作用于SKOV3、HO-8910细胞后β-catenin的表达情况。结果显示，随着孕激素浓度的增加，β-catenin蛋白表达逐渐降低，呈剂量依赖性。这提示孕激素可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来降低卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力。

PGRMC2是新近来发现的一种小分子蛋白，属于孕激素受体膜成分家族的成员[17]。有几项研究结果指出，PGRMC2可能在肿瘤中发挥作用。在子宫颈腺癌的淋巴结转移中，大量PGRMC2的丢失提示PGRMC2可能在子宫颈腺癌转移中起肿瘤抑制因子的作用[17]。此外，Albrecht等[5]研究表明PGRMC2在SKOV3细胞中的升高导致较低的迁移率，而降低PGRMC2水平导致较高的迁移率。关于PGRMC2影响肿瘤转移的机制有研究显示[5]，G-actin单体和F-actin多聚体的比例与细胞的增殖和迁移相关，并且具有侵袭性的肿瘤细胞显示出与肌动蛋白聚合相关的信号通路的改变。此外，有文献显示类固醇激素信号传导可引起肌动蛋白细胞骨架的重组，这表明PGRMC2作为推定的孕酮受体可能通过肌动蛋白细胞骨架的重组介导细胞的迁移、侵袭作用。有研究发现在前列腺癌细胞中长期使用睾酮刺激可出现肌动蛋白的解聚。相反，细胞短时间暴露于睾酮会导致肌动蛋白聚合，这些作用是由睾酮膜受体介导的。但Albrecht等的研究中未检测到肌动蛋白细胞骨架的重组参与PGRMC2的迁移调节作用，他们推测PGRMC2可能通过作用一系列的细胞黏附分子来影响细胞迁移。总之，PGRMC2影响迁移的机制仍不清楚，需要进一步深入探究。

本实验选取两株人卵巢浆液性囊腺癌SKOV3、HO-8910细胞，运用不同浓度的孕激素作用于细胞并检测其PGRMC2表达情况。据了解，不同分化程度的卵巢癌中是否存在PGRMC2表达变化，国内外未见相关文献报道。本实验首次探究了PGRMC2蛋白在卵巢癌SKOV3、HO-8910细胞中的表达情况。Western blot法显示，PGRMC2在两株癌细胞中均有表达，其中HO-8910细胞的PGRMC2蛋白相对表达量较SKOV3显著升高。另外还发现，不同浓度孕激素处理后两株细胞的PGRMC2蛋白表达不受影响。但β-catenin蛋白表达降低，且β-catenin蛋白在PGRMC2表达较高的HO-8910中调节得更明显。由于细胞对孕激素的反应取决于孕酮受体，这提示在卵巢癌细胞中存在功能性孕酮受体。由于本实验未采用siRNA技术沉默PGRMC2来观察Wnt/β-catenin相应蛋白有无变化，因为无法确切说明Wnt/β-catenin信号通路组分的改变是由PGRMC2特异性介导的。

综上所述，本实验发现，相对于PGRMC2表达较低的SKOV3细胞来说，孕激素抑制PGRMC2表达较高的HO-8910细胞的增殖、迁移及侵袭能力更强。这种作用可能由PGRMC2介导，通过调节Wnt通路引起EMT相关蛋白E-cadherin、β-catenin的改变从而影响卵巢癌细胞的转移。然而，卵巢癌细胞中存在多种信号通路的异常活化，其中包括PI3K/Akt、TGF-β/SMAD等通路。有研究表明[13]，孕激素通过调节PIK3/AKT信号通路增加肿瘤抑制基因nm23-H1的表达从而抑制细胞迁移和侵袭。可见卵巢癌转移的机制并非是单个通路发挥作用，其可能是多个通路相互影响。另外，孕激素各个类型的受体(PGRMC1、PGRMC2、PR/A、PR/B)之间的相互作用仍不清楚。因此需进一步开展实验来了解各个通路之间的相互作用。