盐酸脱钙液后脱钙在骨髓组织活检中的应用及体会

施栋梁，胡晓梅，郑宇辉，邱小文，黄建平，杨映红

骨髓组织活检是明确骨髓病变最主要的方法之一，但由于骨髓组织中含有大量的磷酸钙和碳酸钙，在常规制片中易致切片破碎、刀痕严重等问题，因此对骨髓组织进行充分的脱钙也显得格外重要[1-2]。目前在临床工作中，我们常使用的脱钙液有酸类脱钙液、电解质脱钙液、螯合剂脱钙液、离子交换树脂脱钙液等[2-3]。这些脱钙液作用机制不同，效果各有千秋[4]。在实际临床工作中我们对脱钙液选择的标准应该是效果强、时间短、对组织细胞形态以及对抗原影响小等[5]。本实验室根据多年的工作经验，采用2%盐酸脱钙液应用于骨髓组织活检中，并取得了良好的效果，现将方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集福建医科大学附属协和医院病理科2018年1月～2019年3月使用2%盐酸脱钙液脱钙的骨髓组织活检标本500例。标本类型为骨髓穿刺活检组织，标本直径0.2 cm，长度>1.0 cm。

1.2 实验仪器及试剂全自动染色仪HE600购自美国Ventana公司；TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda购自福州迈新公司；PAX5购自美国罗氏公司；二抗、柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)、DAB显色试剂盒，均购自福州迈新公司；浓盐酸溶液(盐酸含量36%～38%)购自上海试一化学公司。

1.3 方法

1.3.12%盐酸脱钙液配制 取5.4 mL浓盐酸(盐酸浓度36%～38%)和94.6 mL蒸馏水，制成浓度为2%盐酸脱钙液。

1.3.2脱钙方法(后脱钙法) 新鲜的骨髓穿刺组织经取材后及时用10%中性福尔马林固定4～6 h；在全自动脱水机中脱水、浸蜡；包埋时将骨髓组织沿包埋框的对角线放置，待冷却后制成蜡块；蜡块修整时充分暴露骨髓组织最大面，随后将最大组织面浸泡于2%盐酸脱钙液中，使得盐酸脱钙液充分与骨髓组织表面接触；每5～10 min用大头针探测骨髓组织表面，当大头针能轻易刺入组织时提示脱钙完成，若刺入时有阻力则需继续脱钙。脱钙后将骨髓活检组织置于冰盘上，待进行常规切片。

1.3.3HE染色 常规组织切片后应用Ventana HE600进行骨髓HE染色。

1.3.4免疫组化 采用免疫组化EnVision两步法染色，70 ℃烤片60 min，二甲苯脱蜡20 min至无水乙醇溶液，水洗，柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)高压锅修复2.5 min，3%过氧化氢封闭10 min，PBS冲洗，分别滴加一抗，室温孵育120 min，PBS冲洗，滴加增强剂孵育20 min，PBS冲洗后滴加二抗，孵育30 min，PBS冲洗，DAB室温显色3～5 min，自来水冲洗终止显色，苏木精复染，氨水返蓝，脱水、透明、封固。

1.3.5抗体选择及结果判定 选取在急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤诊断中常用的抗体。PAX5(MX017)、TdT(SEN28)是细胞核抗原，CD20(L26)、CD56(MX039)是细胞膜抗原，Kappa(多克隆)、Lambda(LAM03+HP6054)是细胞质抗原。切片按照染色阳性强度分别进行评估，分为强阳性()、中等阳性()、弱阳性(+)和阴性(-)。其中阴性和弱阳性为低表达，中等阳性和强阳性为高表达。

2 结果

2.1 脱钙时间及制片效果骨髓组织经2%盐酸脱钙液处理后，平均脱钙时间为(65±15) min，脱钙时间较短。应用该方法制片效果良好，制片时易切出完整的切片，且对刀片的损伤小(图1)。

2.2 HE染色骨髓组织经2%盐酸脱钙液处理后，HE染色显示骨髓组织形态完整，结构清晰，细胞核和细胞质层次分明，透明度好(图2)。按照HE制片质控评价指标进行评价，HE染色平均得分为91分(>90分为优质的玻片标本)。

2.3 免疫组化染色PAX5、TdT阳性定位于细胞核，CD20、CD56阳性定位于细胞膜，Kappa、Lambda定位于细胞质。PAX5、TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda在组织中表达良好，阳性定位准确，背景清晰(图3)。

图1 应用2%盐酸脱钙液脱钙后骨髓组织制片效果

图2 骨髓组织HE染色，结构清晰，透明度好

图3骨髓免疫组化染色：A.TdT；B.CD20；C.CD56；D.Kappa，EnVision两步法

3 讨论

骨髓组织中含有大量的磷酸钙和碳酸钙，在常规石蜡切片中容易造成切片破碎、刀痕严重等问题，因此充分的脱钙是制成优质HE切片的前提[1]。在实际工作中脱钙时间的掌握是制片成功与否的关键。脱钙时间太短时切片破碎、刀痕严重；脱钙时间过长时HE染色不佳、免疫组化染色易出现假阴性[3]。目前常用的脱钙方法中，电解质脱钙法实验过程繁琐，需要安装特殊设备；螯合剂脱钙法对组织破坏小，但脱钙作用异常缓慢；酸类脱钙法脱钙时间短，操作简易，是临床工作中最常用的脱钙方法[2,6]，因此在本实验中选用酸类脱钙液。

大部分实验室采用的是“前脱钙法”，也就是骨髓组织在脱水、石蜡包埋前浸泡在各类的脱钙液中进行脱钙，等脱钙完成后再进行脱水、石蜡包埋[7]。本实验采用的是“后脱钙法”，即骨髓组织经固定、取材、脱水、石蜡包埋后进行蜡块修整，充分暴露最大组织面后浸泡于2%盐酸脱钙液中，待脱钙完成后进行制片。应用该方法进行脱钙后，脱钙时间明显缩短，若个别标本在制片时仍有切片破碎时，只需再浸泡1～2 min即可顺利完成制片，且制片效果优良。在HE染色中，骨髓组织形态完整，结构清晰，细胞核和细胞质层次分明，透明度好，达到优质HE染色片的要求。

有文献报道酸性脱钙液对骨髓组织抗原有一定的破坏性，长时间的酸处理容易造成抗原破坏，使得免疫组化染色出现假阴性，进而影响诊断[6,8]。在骨髓组织中，抗原表达情况对骨髓疾病诊断至关重要，因此脱钙液的选择应该满足对抗原影响小这一必要条件[1]。为了探讨2%盐酸脱钙液对骨髓组织抗原表达情况的影响，本实验选取了临床实际工作中常用的抗体，分别定位于细胞核(PAX5、TdT)、细胞质(CD20、CD56)、细胞膜(Kappa、Lambda)。经2%盐酸脱钙液处理后，PAX5、TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda在组织中表达良好，阳性定位准确，背景清晰。这一结果提示低浓度、短时间的脱钙处理，对骨髓组织抗原完整性影响小，从而避免了免疫组化假阴性的产生。

总之，在骨髓组织活检中，通过2%盐酸脱钙液后脱钙的处理方法，不仅能够制出优良的HE切片，而且低浓度、短时间的酸处理能够最大限度的保护抗原，避免了免疫组化中假阴性的产生。该方法值得在各个实验室中推广使用。