荧光原位杂交与染色体核型分析对骨髓增生异常综合征的诊断作用

李静 胡建威 刘庆荣

(唐山市工人医院，河北 唐山 063000)

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组起源于造血干细胞的血液系统恶性肿瘤性疾病，表现为一系或多系血细胞发育异常，无效造血，并可出现原始细胞的增多，临床表现为贫血、出血和感染等。MDS是常见的老年血液系统疾病的之一，约80%患者发病时年龄已超过60岁，在70岁以上人群中发病率高达30/10万〔1〕。血细胞形态学改变仍是诊断MDS的重要方法之一，但其与巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血及先天性红细胞生成障碍性贫血等鉴别存在困难，有赖于染色体异常核型的鉴定〔2〕。另外，染色体核型也与国际预后分期系统(IPSS)评分明显相关，是评估MDS预后的重要参考指标〔3〕。目前，常规染色体核型分析(CCA)是确定染色体畸变的推荐方法，但其过度依赖有丝分裂指数，且对小克隆异常敏感性差〔4〕。荧光原位杂交(FISH)是一种新型的检测染色体畸变手段，通过应用荧光标记的特异性核酸探针与靶细胞DNA结合发挥作用，越来越多地应用于MDS患者中。本研究分析联合应用CCA与FISH对MDS患者进行核型分析的效果。

1 资料与方法

1.1一般资料 2012年3月至2016年12月唐山市工人医院血液科住院治疗的78例MDS患者，均符合维也纳最低诊断标准〔5〕。其中男43例，女35例，年龄60～86岁，中位年龄67岁。依据2008年WHO分型〔6〕，包括难治性贫血(RA)13例，环形铁粒幼细胞性难治性贫血(RAS)7例，难治性血细胞减少伴多系增生异常(RCMD)21例，难治性贫血伴有原始细胞增多(RAEB)-Ⅰ 15例，RAEB-Ⅱ 17例，5q-综合征2例，MDS 未能分型(MDS-U)3例。同时，选取同期单纯缺铁性贫血患者10例，作为FISH阳性标准建立组，男、女各5例，年龄61～80岁，中位年龄68岁。

1.2染色体核型分析 采用短期骨髓细胞培养法。抽取骨髓液2～3 ml，置于肝素钠抗凝管中，接种到含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养23 h后，加入0.05 μg/ml的秋水仙酰胺终止分裂，再培养1 h。培养24 h后，收集细胞，应用0.075 mol/L的氯化钾溶液低渗处理30 min，然后应用3∶1的甲醇、冰醋酸混合液固定3次，最后将细胞悬液滴于经冰水浸泡过的载玻片上，气干处理。应用0.025%胰酶溶液消化后，10%Giemsa染色，采用显带技术进行核型分析，要求每例标本分析20个中期分裂象。当2个及以上分裂象出现相同染色体数量增加或结构异常，或3个及以上分裂象出现同一染色体丢失时，认定为染色体核型异常。

1.3FISH

1.3.1荧光探针 探针购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，供检测5/7/8/20/Y染色体异常，分别包括：GLP CSF1R/GLP D5S23，D5S721(5q33，5p15)；GLP EGR1/GLP D5S23，D5S721(5q31，5p15)；GLP D7S486/CSP7(7q31，7p11-q11)；GLP D7S522/CSP7(7q31，7p11-q11)；GLPD20S108/CSP8(20q12，8p11-q11)；CSPY(Yp11.1-q11.1)。正常细胞在荧光显微镜下表现为2红2绿；当出现整条染色体缺失时(如-5、-7)，表现为1红1绿；出现染色体长臂缺失时(如5q-、7q-、20q-)，表现为1红2绿，染色体数目增加时(如+8)，表现为3绿；Y染色体缺失时仅表现为1绿，无红色信号出现。

1.3.2原位杂交 抽取骨髓液3 ml，置于肝素钠抗凝管中，加入2倍体积的生理盐水，离心后弃上清，重复3次，然后加入到预热至37℃的0.075 mol/L氯化钾溶液内低渗处理30 min，应用3∶1的甲醇、冰醋酸混合液固定3次，最后将细胞悬液滴于无脂载玻片上，自然干燥后-20℃冰箱保存备用。取出玻片，56℃老化处理30 min，70%、85%、100%乙醇各脱水2 min，加入2∶8配置的探针、杂交缓冲液，封片，72℃变性5 min，46℃湿盒中杂交16 h。杂交后，应用NP-40缓冲液洗涤，避光晾干，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染20 min，荧光显微镜下观察，要求每例标本计数200个间期细胞。

1.4统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行χ2检验或Fisher确切概率法、秩和检验。

2 结 果

2.1染色体核型分析 78例共检测出遗传学异常34例(43.59%)，13例因分裂象不足，未能成功进行核型分析，余31例未检测出异常核型。见表1。

2.2FISH

2.2.1各探针的阳性阈值依据阳性标准建立 各染色体异常的阈值分别为：GLP CSF1R/GLP D5S23，D5S721探针 5q->2.53%、-5>4.47%；GLP EGR1/GLP D5S23，D5S721探针 5q->3.04%、-5>3.75%；GLP D7S486/CSP7探针 7q->2.82%、-7>1.35%；GLP D7S522/CSP7探针 7q->3.11%、-7>1.01%；GLPD20S108/CSP8探针 20q->4.23%、-20>2.30%、+8>2.46%；CSPY参照试剂盒定义范围，-Y>15%。

2.2.2原位杂交结果 78例共检测出涉及5/7/8/20/Y 染色体异常者41例(52.56%)，其中，核型分析中13例分裂象不足者，原位杂交阳性6例。两种检测方法的总体染色体异常检出率及各染色体异常检出率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3两种检测方法对IPSS评分的影响 依据IPSS评分标准分组，两种检测方法IPSS积分差异无统计学意义(Z=0.097，P=0.923)。见表2。

表1 染色体异常分布〔n(%),n=78〕

表2 两种检测方法IPSS积分比较〔n(%),n=78〕

3 讨 论

MDS患者染色体畸变的发生率为40%～70%，其种类多种多样，可表现为染色体片段的缺失，也可出现数目的异常，主要涉及+8、-5/5q-、-7/7q-、20q-等异常〔7〕。染色体核型异常是MDS维也纳诊断标准中的三大决定性标准之一，也是评估患者预后的重要参考指标之一。因此，染色体核型的鉴定对MDS的诊疗具有重要临床意义。

CCA通过对骨髓细胞进行短期培养、分析分裂中期的染色体结构判定染色体畸变，其能够全面分析所有的染色体，且理论上能检测到所有的染色体异常，是WHO指定的MDS必查项目。但部分MDS患者因取材较少或分裂象不足等，导致中期分裂象细胞过少，出现核型分析失败；另外，部分MDS患者仅表现为一些微小的克隆性病变，呈现亚显微程度的改变，此时传统的CCA也常无法发现异常〔8，9〕。

FISH是二十世纪八十年代发展起来的一项新兴技术，其通过碱基互补配对原则检测染色体上的碱基改变，具有高度敏感性和准确性的特点。FISH能够直接检测间期细胞，不受分裂象的影响，且其能够一次性分析上万个细胞，具有高通量特点。由于FISH是通过碱基互补配对原则发现DNA的异常，其对亚显微水平的改变亦有较高敏感性。研究证实〔10〕，部分CCA检查正常的MDS患者应用FISH检测仍能发现染色体异常。

本研究结果与国内类似研究基本一致〔11，12〕。在具体核型方面，不同于国外的-5/5q-异常，+8仍是国内MDS患者最常见的染色体异常类型，这与文献〔13〕报道也相同。

本研究说明FISH能提高部分染色体异常的发现率，差异无统计学意义，这可能与样本量较少有关，需大样本研究进一步证实。本研究说明FISH能弥补CCA检测的不足。

由于FISH探针是特异性的，其不能检测其他染色体的异常，可能会出现漏诊。在IPSS评分方面，CCA与FISH两种检测方法的IPSS评分基本相同，但FISH检测方法出现了低危患者例数的增加。以上均不利于MDS患者的病情评估。因此，部分学者认为FISH对CCA检测成功患者诊断价值有限，仅对CCA检测失败或CCA检测正常核型患者具有较好的辅助作用〔14〕。

近年来研发的一些新型探针技术，如M-FISH和SKY技术等〔15〕，能够同时检测所有的染色体异常，有望弥补FISH探针不足，替代CCA成为MDS患者的标准检测方法，但其花费较高，目前尚未广泛应用于临床，其价值有待进一步评估。

综上，CCA仍是目前判定MDS患者染色体异常的基础方法，FISH能够提高常见染色体异常检出率，但更适用于核型分析失败或正常患者，CCA与FISH联用更有利于染色体异常的鉴定。