sPD-1、IFY-γ、IL-12、IL-10及T淋巴细胞CD4+、CD8+在慢性乙肝患者血浆中的表达及临床意义

柯淑慧 杨伟琴 吴炳 张涵斌

(1浙江中医药大学，浙江 杭州 310000；2台州市椒江区妇幼保健院检验科；3台州市仙居县中医院检验科；4台州市黄岩区妇幼保健院检验科)

全世界范围内有超过2.4亿人感染慢性乙型肝炎病毒(HBV)。在乙肝最流行的亚太地区，慢性HBV感染是肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的主要原因。慢性乙型肝炎的临床实验表明发病机制中细胞因子白细胞介素(IL)-12与干扰素(IFN)-γ发挥很大作用。可溶性程序性死亡受体(sPD)-1是一种表达于多种人体免疫系统的分子，包括T细胞、B细胞、骨髓细胞、胸腺细胞和自然杀伤细胞，sPD-1表达与癌症和慢性感染中的T细胞衰竭有关。在HBV患者衰竭T细胞上存在的许多抑制性受体中，PD-1表达最高，特别是在肝脏内HBV特异性T细胞上。PD-L1是PD-1的主要配体之一，通常发现于肝脏细胞中，在慢性感染环境中其表达增加。免疫细胞sPD-1表达上调可在病毒感染〔如HBV、人类免疫缺陷病毒(HIV)〕中检测到，表明sPD-1可能是影响感染持续性的一个重要因素〔1〕。了解患者体检的各项指标对临床中患者的预后具有重要意义，此次研究通过监测慢性乙肝患者血浆中sPD-1、IFY-γ、IL-12、IL-10指标明确其对患者预后的影响。

1 资料和方法

1.1研究对象 选取2017年9月至2018年11月于台州市椒江区妇幼保健院、台州市仙居县中医院及台州市黄岩区妇幼保健院三家医院的慢性乙型肝炎患者100例，其中男80例，女20例，年龄62～75岁，其中中期慢性肝炎52例，晚期慢性重型肝炎48例。诊断符合2000年西安全国肝病会议《病毒性肝炎防治方案》的诊断规范〔2〕。根据患者的治疗效果、乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)存活者长期预后及健康相关的生存质量将其分为两组：好转组80例，平均年龄(65.1±3.2)岁；死亡组20例(均为晚期患者)，平均年龄(67.8±2.6)岁。选择同期体检的健康者100例为对照组，年龄66～78岁，平均(68.4±4.2)岁。3组一般资料均无显著性差异，具有可比性(P<0.05)，该研究获得医院伦理学委员会的批准。

1.2观察指标 检测受试对象血浆中sPD-1、IL-10、IL-12、IFN-γ的含量，外周血中T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平及肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GT)。sPD-1，IL-10，IL-12、IFN-γ、ALT、AST及γ-GT 酶联免疫检测试剂盒均购于Biolegend；T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+流式细胞学检测试剂盒均购于北京鼎国生物技术有限公司。

1.3检测方法 3组均采取外周血10 ml，置于肝素抗凝管中，1 500 r/min，离心10 min，取血浆3.0 ml，保存在-80℃冰箱中，检测时应用37℃水浴解冻，应用双抗体夹心法检测血浆sPD-1，IL-10，IL-12和IFN-γ水平。取2 ml肝素抗凝血，加磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至4 ml，缓慢加至2 ml Ficoll淋巴分离液上层，2 000 r/min离心20 min后吸取单个核细胞。PBS洗涤后将细胞重悬于100 μl PBS，与抗体异硫氰酸荧光素(FITC)-CD4、Percp-CD8孵育30 min，PBS洗涤2遍后重悬于500 μl PBS，在流式细胞仪Beckman Coulter Navios进行检测。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验、Pearson检验、Logistic回归分析。

2 结 果

2.1各组血浆中sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ指标的比较 好转组与对照组sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ含量明显低于死亡组(均P<0.05)。好转组SPD-1、IL-12水平显著高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组血浆中sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ指标的比较

与死亡组相比：1)P<0.05；与对照组相比：2)P<0.05

2.2各组外周血中T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平比较 死亡组CD4+水平为(45.8±7.2)%，好转组为(37.8±5.3)%，对照组为(46.6±3.4)%；而死亡组CD8+水平为(39.1±3.8)%，好转组为(32.2±6.2)%，对照组为(27.1±4.7)%。死亡组和好转组CD4+水平明显低于对照组(P<0.05)、CD8+水平明显高于对照组，差异显著均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 各组外周血中T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平

2.3sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ与肝功能指标的相关性 与对照组相比，好转组和死亡组ALT、AST、γ-GT均显著升高(均P<0.05)。见表2。sPD-1、CD4+水平与肝功能指标(ALT、AST、γ-GT)呈正相关(r=0.639、0.712、0.598、0.726、0.703、0.608，均P<0.05)；IL-10水平与ALT、AST、γ-GT呈正相关(r=0.546、0.642、0.575，均P<0.05)；IL-12、IFN-γ与肝功能指标无明显相关。

表2 各组肝功能指标的比较

与对照组相比：1)P<0.05

2.4sPD-1、IL-10对慢性重型肝炎的预后分析 Logistic回归模型显示，血浆内sPD-1、IL-10含量高的患者风险较大(sPD-1:HR=1.002,95%CI:0.780～1.262;IL-10:HR=1.005,95%CI:0.653～1.482)。

3 讨 论

慢性乙型肝炎后期表现有乏力、纳差、腹胀等，可伴有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣或肝脾肿大。慢性乙型肝炎患者病情不同阶段生理表达不同，早期呈现细胞因子IL-10大量分泌，早期是医治痊愈的最好时期，中期到后期IL-12与ILN-γ的含量极速增长，早期应用肝细胞生长素可降低病死率〔3〕。IFN-γ、IL-12和IL-10代表体内Th1与 Th2反应，(IFN-γ+ IL-12)/IL-10比值变化代表人体免疫反应的方向，如果比值偏小，则提示慢性化可能，Child-Pugh、终末期肝病模型(MELD)和白蛋白-胆红素(ALBI)评分预测肝硬化合并慢加急性肝衰竭患者院内死亡风险〔4〕，如果比值偏大，则提示机体含有剧烈的免疫反应。若早期细胞因子IL-10分泌则该患者痊愈概率大，若观察指标含量以IFN-γ与IL-12的增多为主，且远远高于正常指标含量，则可判断该患者为慢性重型肝死亡。慢性肝炎患者在不同病情阶段血浆中各指标含量不同，早期以IL-10含量增多为主。患者往往存在严重的血小板减少现象，晚期则以IFN-γ和IL-12分泌含量快速增长为主。肝衰竭死亡时期依次随时间推移IL-12与IFY-γ含量增多，抑制细胞因子分泌是防治慢性肝炎的可能的方法之一。

慢性乙型肝炎病毒感染的过程是一个动态的过程，是病毒复制和宿主免疫相互作用的结果。T细胞异常表达免疫分子参与慢性乙肝的病理过程〔5～7〕，机体感染乙肝病毒后可发生T淋巴细胞亚群改变。PD-1为近年发现的T细胞表面CD28家族新成员〔8～10〕，但PD-1在乙肝中的具体机制不明确，有研究表明PD-1介导的负向调控与慢性病毒感染有密切关系〔11～13〕。研究证实，抑制T细胞过度表达的PD-1及其受体PD-L1可有效抑制乙肝病毒，有望成为治疗肝癌的新型治疗方法〔14～21〕。