HOTAIR EZH2和VEGF在鼻咽癌组织中的表达情况及其对预后的影响

叶贝华，傅 明，何锦添，陈顺金, 蒋 迪

(广东省东莞市人民医院耳鼻咽喉科, 广东 东莞 523000)

鼻咽癌是我国常见的一种头颈部恶性肿瘤，尤其高发于南方地区，其病理类型以未分化癌和低分化癌为多见，而放射治疗是目前临床采用的治疗方法[1]。研究指出，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在鼻咽癌患者血清中的水平明显升高，其与患者病理分级、TNM分期、淋巴结转移均存在密切关系[2]。研究报道，zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)可通过结合血管抑制蛋白1的启动子而阻滞该蛋白表达，并进一步促使VEGF表达水平升高，从而诱导肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤远处转移的发生[3]。作为首个新发现的反式调控作用的长链非编码RNA，Hox转录反义RNA(Hox transcript antisense RNA,HOTAIR)高表达于头颈部肿瘤。为此，本研究通过检测鼻咽癌患者VEGF、EZH2和HOTAIR的表达情况，并进一步探讨HOTAIR表达水平与患者预后状况的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料:采用回顾性研究，收集2016年6月至2019年6月本院72例鼻咽癌(鼻咽癌组)和54例鼻咽慢性炎症(对照组)患者的临床资料。纳入标准：鼻咽癌组患者均经鼻咽活检和病理检查证实为鼻咽癌，初治；对照组均由于淋巴组织增生而行鼻咽活检，且经病理检查证实为鼻咽慢性炎症。排除标准：伴有其它全身其它恶性肿瘤；复发性鼻咽癌；临床资料不全。其中，鼻咽癌组男57例(79.17%)，女15例(20.83%)；年龄20～74岁，平均(49.97±8.73)岁。对照组男39例(72.22%)，女15例(27.78%)；年龄21～72岁，平均(46.50±9.17)岁。两组患者性别和年龄的比较，均无明显差异(均P>0.05)。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组织化学法的检测:通过免疫组织化学法检测两组VEGF和EZH2蛋白表达情况，方法如下：取患者鼻咽组织，经石蜡包埋，连续切片，行免疫组织化学检测。根据着色深度，分为0分：无着色；1分：着色不明显；2分：着色中等；3分：着色程度强；根据阳性细胞比例，分为0分：无阳性细胞；1分：阳性细胞数比例低于50%；2分：阳性细胞数比例51%～75%；3分：阳性细胞数比例>75%。以着色程度评分与阳性细胞比例评分之和为总分。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应的检测:采用实时荧光定量聚合酶链反应检测患者VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA的表达情况，方法如下：根据Trizol试剂盒(美国Ambion公司)提取两组鼻咽组织总RNA，测定RND浓度，采用反转录试剂盒(美国Promege公司)逆转录为cDNA。对引物序列进行设计，以GAPDH为内参照，行实时荧光定量聚合酶链反应。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s,72℃延伸30s，共进行40个循环。以2-△△Ct法对VEGF、EZH2、HOTAIR mRNA相对表达量进行定量分析。

2 结 果

2.1 鼻咽癌组与对照组患者VEGF和EZH2蛋白免疫组织化学评分的比较:鼻咽癌组VEGF和EZH2蛋白均明显高于对照组(P<0.001)。见表1。

表1 鼻咽癌组与对照组患者VEGF和EZH2蛋白免疫组织化学评分的比较分)

2.2 鼻咽癌组与对照组VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA表达情况的比较:相比对照组，鼻咽癌组VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA相对表达量均明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 鼻咽癌组与对照组VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA表达情况的比较

2.3 HOTAIR mRNA表达与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性:采用2-△△Ct法计算HOTAIR mRNA相对表达量，结果显示HOTAIR mRNA在鼻咽癌组的相对表达量中位数为6.12，以该值作为界值，分为低表达组(HOTAIR mRNA<6.12)36例和高表达组(HOTAIR mRNA≥6.12)36例。结果显示，不同病理分级、N分期、M分期、近期疗效的患者HOTAIR mRNA表达情况的比较，均存在明显差异(P<0.05)；两组年龄、性别、病理类型的比较，均无明显差异(P>0.05)。见表3。

表3 不同特征的患者HOTAIR mRNA表达情况的比较n(%)

3 讨 论

马赛[4]等研究显示，VEGF蛋白在涎腺黏液表皮样癌中的阳性表达率较正常涎腺组织明显升高，并且其表达阳性率与涎腺黏液表皮样癌TNM分期、病理分级、淋巴结转移均密切相关。高立生[5]等研究表明，VEGF高表达于喉鳞癌组织；史建伟[6]等研究发现，VEGF高表达于胃癌组织，二者研究发现VEGF高表达在喉鳞癌和胃癌发生、发展、侵袭、转移过程中发挥着重要的促进作用。殷伟杰[7]研究报道，EZH2蛋白和mRNA均异常高表达于肾癌组织，并且其高表达于患者预后不良密切相关。另有研究显示，VEGF高表达于肺癌组织[8]，而EZH2高表达于泌尿系统恶性肿瘤组织[9]，且二者表达量往往与癌细胞增殖、侵袭能力均密切相关。张乐[10]研究发现，EZH2阻滞剂DZNep具有阻滞食管鳞癌移植瘤增长的作用，同时可促进肿瘤细胞凋亡。随着近年来对长链非编码RNA与肿瘤病理过程相关性的研究不断深入，已有研究表明HOTAIR与多种恶性肿瘤远处转移的发生密切相关，如胃癌和乳腺癌等[11]。并且，HOTAIR可通过募集染色质修饰复合体2、组蛋白去甲基化酶1蛋白复合体，发挥调控p53、Akt、Wnt等多种信号通路的作用，并且其异常表达具有影响头颈部肿瘤细胞侵袭、转移、凋亡、细胞周期及新生血管形成等作用[12]。有关HOTAIR诱导肿瘤远处转移的分子机制研究表明，HOTAIR的5端可通过结合染色质修饰复合体2蛋白复合物，使其果蝇EZH2蛋白介导H3组蛋白27位赖氨酸的甲基化，促使染色质构型改变，促进染色质的表观遗传沉默[13]。

陈文慧[14]等研究报道，HOTAIR高表达于鼻咽癌组织，且其表达水平与患者N分期有关，同时与患者预后不良密切相关。本研究发现，鼻咽癌组VEGF和EZH2蛋白表达水平均明显高于对照组。此外，相比对照组，鼻咽癌组VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA相对表达量均明显升高，结果表明VEGF、EZH2和HOTAIR高表达于鼻咽癌组织，与上述研究报道相符。同时，本研究显示，高表达组病理分级、N分期、M分期、近期疗效与低表达组比较，均存在明显差异。结果表明，HOTAIR在鼻咽癌组织中的高表达与患者预后不良、肿瘤远处转移密切相关。分析其原因，可能在于HOTAIR在鼻咽癌组织中可能通过募集EZH2而促进抑癌基因的表观沉默，促使VEGF表达水平升高，从而起到诱导鼻咽癌肿瘤远处转移的作用。由此推测，HOTAIR可能是预测鼻咽癌预后状况的潜在生物学标志物，进而可能是鼻咽癌患者临床治疗的一种新靶点。

综上所述，VEGF、EZH2和HOTAIR高表达于鼻咽癌组织，并且HOTAIR可能通过EZH2和VEGF而起到诱导鼻咽癌远处转移的作用，且与患者预后不良存在密切关系。但目前有关HOTAIR在鼻咽癌发生、发展、侵袭、转移等病理过程中的具体作用机制尚未完全明确，需今后进一步研究和证实。