HPLC法测定不同种源辣木叶花茎中异槲皮苷和新绿原酸的含量

普天磊，邓红山，廖承飞，罗会英，范建成，金杰，韩学琴

（云南省农业科学院热区生态农业研究所元谋干热河谷植物园，云南元谋651300）

辣木为辣木科辣木属植物Moringa oleifera Lam，为多年生热带落叶乔木。辣木叶、花、茎、果实等部位含有丰富的营养成分和药用成分，广泛应用于医药[1-2]、食品[3-4]、动物饲料[5]、净水[6]等领域，被誉为“奇迹之树”。辣木的活性成分主要有黄酮类、酚酸类、多糖类、生物碱等[7]。其中，黄酮和酚酸类成分是辣木发挥抗氧化、抗菌消炎、肝脏保护、降血压等药理作用的物质基础，是辣木中较为重要的活性成分[8-10]。

辣木并无质量控制标准，相关的质量控制文献报道也较为罕见，辣木活性成分的含量测定主要集中于黄酮及酚酸类，对于该类成分中的单体化合物的含量、性质等研究甚少。目前，辣木中的黄酮和酚酸类成分的测定研究主要采用的是紫外分光光度法[11-13]，该法虽然具有操作简单、分析速度快、设备成本低等优势，但特异性差，对与待检物有相同吸收波长的杂质也会产生吸收，导致测定结果不准确[14]。高效液相色谱法根据待测物的极性进行分离检测，可有效避免上述不足，同时方法灵敏度高、重复性好、准确度高，广泛应用于单体成分的分析检测[15]。植物的来源地、使用部位不同，活性成分种类、含量差别较大，而活性成分的含量将直接影响其生理功能[16]，因此有必要对不同种源辣木各部位的黄酮和酚酸类的含量进行系统研究。然而，目前并没有相关文献对辣木不同种源、不同部位中的黄酮和酚酸类成分的具体分布情况进行报道。吉莉莉表明[17]，异槲皮苷为辣木叶黄酮的主要单体成分，且具有降血糖、减轻氧化应激、抑制炎性反应、降血脂等生理功能。高秋玉等[18]发现除异槲皮苷为代表的黄酮类成分有较强清除自由基能力外，以新绿原酸为代表的酚酸类成分也表现出良好的抗氧化活性，具有抗氧化、抗菌解热、抗血栓、抑制血小板聚集等药理作用[19]。本文在查阅相关文献的基础上，采用高效液相色谱法（high performunce liguid chromatography，HPLC）同时测定辣木中异槲皮苷及新绿原酸的含量，对采集的17份辣木样品的叶、花、茎部位进行了含量分析，为辣木的质量控制及合理开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪，包括G7114A可变波长检测器、G711A四元泵、G7129A进样器：美国安捷伦公司；超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子分析天平：岛津公司；MDJ-A01Y1磨粉机：小熊电器股份有限公司。

1.1.2 试剂

异槲皮苷对照品（纯度＞98%）、新绿原酸对照品（纯度＞98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：SIGMA试剂公司；磷酸（优级纯）：成都市科隆化学品有限公司；乙醇（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；水为超纯水。

辣木样品：采摘于云南省农业科学院热区生态农业研究所辣木创新研究基地，YLM为不同来源地的辣木样品；GY和GYZH均为云南省苴林辣木种植基地所选育的材料，其中GY为种植基地中选育的产量较高的植株，GYZH为苴林基地选育的开花较早的产量较高的植株。辣木样品信息见表1。

表1 辣木样品信息Table 1 The sample information of Moringa oleifera

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的配制

精密称取新绿原酸对照品7.5mg，异槲皮苷对照品7.6 mg，加入乙醇充分溶解并定容至25 mL容量瓶，配制成浓度为0.300 mg/mL新绿原酸、0.304 mg/mL异槲皮苷的混合对照品溶液。

1.2.2 辣木供试品溶液的配制

辣木样品用磨粉机充分粉碎，过40目筛，备用。称取1.0g辣木粉置于25mL容量瓶中，加入50%乙醇20mL，冷浸3h，超声处理30min，放冷，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm有机系微孔滤膜过滤，即得。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5min，10%B；5min～20min，30%B；20 min～25 min，10%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm；柱温 30 ℃；进样量：5 μL。

1.2.4 线性关系考察

精密吸取1.2.1项下混合对照品适量，用50%乙醇分别配制成含 0.015 2、0.030 4、0.076、0.152、0.228 、0.304 mg/mL 的异槲皮苷，及 0.015、0.03、0.075、0.15、0.225、0.300 mg/mL的新绿原酸混合对照品溶液，按1.2.3项下色谱条件进样，测定峰面积，绘制标准曲线。

1.2.5 精密度试验

取混合对照品溶液适量，按1.2.3项下色谱条件进样6次，计算RSD（%）。

1.2.6 稳定性试验

取辣木样品，按1.2.2方法制备供试品溶液，在配制后0、4、8、12、24 h按上述色谱条件测定，计算RSD（%），考察样品在室温放置24 h的稳定性。

1.2.7 重复性试验

准确称取辣木样品6份，按1.2.2方法制备供试品溶液，按1.2.3项下色谱条件测定，记录峰面积，计算RSD（%）。

1.2.8 回收率试验

精密取1.0g辣木样品，分别加入3个浓度水平的混合标准品溶液，按1.2.2项下制备供试品溶液，再按1.2.3项下色谱条件进样测定，计算回收率及相对标准偏差。

1.2.9 样品含量测定与分析

辣木叶、花、茎样品，按1.2.2项下条件制备供试品溶液，精密吸取5 μL，按1.2.3项下色谱条件测定峰面积，各样品平行测定3次，测量样品中异槲皮苷及新绿原酸的含量。测定结果采用SPSS 19软件进行多重比较分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

在该色谱条件下，样品各成分色谱峰分离效果好，且出峰时间与对照品出峰时间一致，对照品及样品溶液的HPLC色谱图见图1。

图1 混合标准液及样品溶液HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram of mixed standard solution and sample solution

2.2 线性关系考察

以对照品浓度C为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得异槲皮苷的回归方程为：Y1=8 122.5X-17.884，R2=0.999 7，新绿原酸的线性回归方程为：Y2=15 812X-63.331，R2=0.999 6，结果表明，异槲皮苷、新绿原酸浓度分别在0.015 2 mg/mL～0.304 mg/mL、0.015 mg/mL～0.300 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

按1.2.5项下方法进行精密度试验，组分峰面积结果见表2，表明仪器精密度良好。

表2 精密度试验结果Table 2 The result of accuracy test

2.4 稳定性试验

按1.2.6项下方法进行稳定性试验，组分在各时间段的峰面积结果见表3，表明样品溶液在室温放置24 h基本稳定。

表3 稳定性试验结果Table 3 The result of stability test

2.5 重复性试验

按1.2.7项下方法进行重复性试验，组分的峰面积结果见表4，表明本方法重复性良好。

2.6 回收率试验

按1.2.8项下方法进行回收率试验，结果表明，异槲皮苷、新绿原酸的平均加标回收率符合分析测定要求，结果见表5。

表4 重复性试验结果Table 4 The result of repetitive test

表5 加标回收率试验结果Table 5 The results of sample recovery rate

2.7 含量测定

2.7.1 不同部位、不同种源辣木样品活性成分含量显著性分析

辣木样品中异槲皮苷、新绿原酸的含量测定结果见表6及图2～图4。

表6 不同部位辣木样品中异槲皮苷、新绿原酸差异分析Table 6 The difference analysis of isoquercitrin and neochlorogenic acid of different parts in Moringa oleifera samples

图2 辣木叶中异槲皮苷和新绿原酸含量Fig.2 The contents of isoquercitrin and neochlorogenic acid in Moringa oleifera leaves

图3 辣木花中异槲皮苷及新绿原酸含量Fig.3 The contents of isoquercitrin and neochlorogenic acid in Moringa oleifera flowers

图4 辣木茎中异槲皮苷及新绿原酸含量Fig.4 The contents of isoquercitrin and neochlorogenic acid in Moringa oleifera stems

表6为17份辣木样品中活性成分在不同部位的含量分布情况（用Mean±SD表示），结果可知，17个辣木样品的不同部位活性成分含量高低特征为：叶＞花＞茎。其中，辣木叶中异槲皮苷和新绿原酸的含量均显著高于花和茎，而花和茎中的异槲皮苷含量无显著性差异，新绿原酸在辣木花和茎中的含量有显著性差异。此外，不同辣木样品的茎与花部位，活性成分含量呈现出趋势为：异槲皮苷＞新绿原酸，这种现象尤其在辣木茎中表现更为明显。

不同辣木样品的有效成分含量差异较大，其中辣木叶中异槲皮苷含量最高的5个样品依次为：GYZH-4（6.14 mg/g）、YLM-3（5.94 mg/g）、GY-2（5.80 mg/g）、YLM-1（5.18 mg/g）、YLM-4（4.57 mg/g），新绿原酸含量最高的5个样品依次为：GY-4（6.14 mg/g）＞GY-2（5.51 mg/g）＞YLM-3（5.28 mg/g）＞GYZH-3（5.18 mg/g）＞YLM-5（5.12 mg/g）。辣木花中异槲皮苷含量最高的5个样品分别为：GYZH-4 （2.46 mg/g）、GYZH-2（2.16 mg/g）、GY-1（2.14 mg/g）、GYZH-3（2.01 mg/g）、YLM-3（1.61 mg/g），新绿原酸含量最高的5个样品依次为：GYZH-6（1.28 mg/g）、GY-2（1.23 mg/g）、GYZH-2（1.20 mg/g）、GY-3（1.13 mg/g）、YLM-2（1.12 mg/g）。辣木茎中活性成分含量最高的5个样品，异槲皮苷依次为：YLM-3（1.92 mg/g）＞GYZH-1（1.79 mg/g）＞GYZH-2（1.74 mg/g）＞GYZH-3（1.72 mg/g）＞YLM-4（1.69 mg/g）；新绿原酸依次为：GYZH-1（0.66 mg/g）、GYZH-6（0.61 mg/g）、GY-2（0.57 mg/g）、YLM-5（0.50 mg/g）、YLM-4（0.50 mg/g）。对于不同来源地的辣木样品而言，来源于古巴的YLM-3叶、花、茎3个部位异槲皮苷（分别为 5.94 mg/g、1.61mg/g、1.92 mg/g） 和新绿原酸含量（分别为 5.28、1.06、0.49 mg/g）均较高，来源于老挝的YLM-1仅叶和花中异槲皮苷含量高，值分别为5.18、1.57 mg/g；来源于美国的YLM-2和印度的YLM-4活性成分在叶、花、茎内含量适中（异槲皮苷含量在4.57 mg/g～0.92 mg/g之间，新绿原酸含量在4.79 mg/g～0.40 mg/g之间）；来源于马里的YLM-5仅叶中新绿原酸含量高，为5.12 mg/g。

2.7.2 不同辣木样品活性成分的聚类分析

采用SPSS19软件以系统聚类法对不同种源不同部位的17份辣木样品中异槲皮苷和新绿原酸的含量进行聚类分析，结果见图5。

图5 不同辣木样品活性成分的聚类分析Fig.5 Cluster analysis of active ingredients of different Moringa oleifera varieties

在欧式距离为10时，可将辣木样品分为5类，其中，YLM-3和GY-2为I类群，其特点为异槲皮苷和新绿原酸在辣木叶、花、茎中的含量均较高。YLM-1和GYZH-4为II类群，特点为异槲皮苷在辣木叶和花中的含量高，在茎中含量为中下等水平，新绿原酸在叶、花、茎中的含量低。YLM-2、YLM-4、GY-1、GY-3、GYZH-1、GYZH-2、GYZH-3、GYZH-5、GYZH-6、GYZH-8为III类群，特点为辣木叶、花、茎中活性成分含量适中，既没有偏高也没有偏低的表现。YLM-5和GY-4为IV类群，特点为新绿原酸在叶中含量高，在花和茎中含量整体偏低，异槲皮苷的在叶、花、茎中的含量偏低。GYZH-7为V类群，特点为两种活性成分在不同部位的含量分布均较低。

3 讨论

异槲皮苷及新绿原酸分别为黄酮及酚酸类成分，呈亲水性，在乙醇、乙腈、甲醇等溶液中溶解性良好，考虑到异槲皮苷及新绿原酸在乙醇溶液中溶解性良好，且乙腈、甲醇等溶液毒害性较强，因此采用乙醇作为本试验的溶媒。

已有相关文献对辣木中不同部位的多糖类成分进行比较研究，孙鸣燕等[20]表明，辣木多糖在不同部位的含量趋势为：根＞叶＞种子＞叶柄；任飞等[21]表明辣木多糖在茎中含量最高，叶片中次之，叶柄中最低。酚酸和黄酮类物质是辣木发挥抗氧化及抗菌功能的重要物质基础[9]，其在辣木不同部位中的分布情况并未进行系统的比较研究，本研究发现辣木异槲皮苷及新绿原酸的含量高低趋势为：叶＞花＞茎，目前辣木中黄酮与酚酸的研究部位绝大多数为叶片，与本文研究相符[22-23]，因此，在对辣木中的黄酮及酚酸类物质进行研究时，推荐选择叶片作为研究部位。此外，辣木花和茎活性成分中，异槲皮苷的含量大于新绿原酸，特别是在辣木茎中，异槲皮苷的值明显高于新绿原酸。

来源地会对植物中的活性成分种类和含量造成影响，不同来源地的辣木样品中异槲皮苷和新绿原酸均被检出，但含量有一定差异，这可能与生态环境、土壤、气候、种植等因素有关，开发者可根据不同用途和需求选择相应的材料及使用部位。若用于降血糖、抑制炎性反应、降血脂等领域，可选YLM-1的叶和花部位[24]；若用于抗氧化、抗菌解热、抗血栓、抑制血小板聚集等领域，可选YLM-5的叶部位[19，25]。此外，与GY相比，开花较早的GYZH早熟辣木材料的活性成分并没有偏高或低的表现趋势，即早熟特性不对辣木中的活性成分造成影响。

本研究建立的HPLC法操作简便，重复性、稳定性好，样品测定时间适宜，可同时测定辣木全株中异槲皮苷和新绿原酸的含量，为其质量控制提供方法和参考依据。