洋葱外植体的组织培养方法与对策

何林玉，惠林冲，陈微，杨海峰，李威亚，缪美华，陈振泰，潘美红

(连云港市农业科学院 蔬菜研究室，江苏 连云港 222000)

洋葱(AlliumcepaL.)是百合科葱属2年生植物，是重要的园艺蔬菜之一，已有4 000多年的栽培历史，在中国广泛栽培。洋葱选育周期长，遗传背景复杂，杂种优势明显。在洋葱杂交育种中，对优良的不育系亲本材料进行扩繁，需要利用组织培养的方法。本实验室目前只掌握了利用洋葱外植体进行愈伤诱导的方法，再生体系还未建立。在洋葱组织培养中，经常会出现污染现象，浪费了大量的耗材和人力。所以本研究对洋葱外植体的组织培养方法进行研究，以减低污染率，为洋葱现代化分子辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 器材消毒与灭菌

镊子、超纯水、培养皿、1 mL枪头(放入组培瓶中)、手术刀、配套的滤纸(放入相对应的培养皿内)均用报纸包好，放入灭菌锅内121 ℃高压灭菌20 min[1]。组培室开紫外灯30 min后关闭，约20 min后进入组培室关闭超净工作台和室内的紫外灯。

1.2 培养基的制备

以MS为基础培养基，加入1.8 mg·L-12,4-D、30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1琼脂，调节pH为6.0～6.2，编号为①。以MS为基础培养基，加入8 g·L-1琼脂、30 g·L-1蔗糖，调节pH为6.0～6.2，编号为②。以MS为基础培养基，加入1.0 mg·L-12,4-D、1.0 mg·L-16-BA、30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1琼脂，调节pH为6.0～6.2，编号为③。90 mm培养皿用报纸包好，与培养基一同放入灭菌锅内121 ℃高压灭菌20 min。将2 mg·L-1甘氨酸、1 g·L-1酪蛋白水解物、690 mg·L-1脯氨酸溶于无菌水中[2]，在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌后加入灭完菌的培养基①、③内，充分摇匀后用90 mm培养皿进行分装，每个培养皿约30 mL培养基。

1.3 洋葱外植体消毒

鳞茎盘消毒：选取无病虫害、球形较好的洋葱葱球，剥去外表皮和肉质鳞片约2/3，去掉底部须根，注意勿伤及鳞茎盘及其生长点。自来水下冲洗约20 min，放入工作台中消毒备用。在工作台内用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗1次，有效氯为14%的次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干表面水分[2]。

种子消毒：选取颗粒饱满的洋葱种子，自来水下冲洗10 min，超净工作台内用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗1次，有效氯为2%的次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干表面水分。因洋葱种子质量小，易漂浮，消毒过程中可来回轻微晃动，使其充分与消毒液接触，也可用无菌纱布套住消毒瓶口，倒掉废液时防止种子随废液一起流出。

花苞消毒：选取无病虫害且未开的花苞，留花梗约5 cm，置于自来水下冲洗10 min，在超净工作台内用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗1次，有效氯为10%的次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干表面水分。

花朵消毒：选取无病虫害且未开放的2.5～3.5 mm的花蕾[3]，留花柄约1.0 cm，剪去其他部分，自来水下冲洗20 min，超净工作台内用70%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗1次，有效氯为2%的次氯酸钠浸泡消毒15 min，无菌水冲洗3～4次，在无菌滤纸上晾干表面水分。

1.4 外植体接种培养基

晾干水分的鳞茎盘，用无菌刀片切去与消毒液接触的表面，取中间部分约5.0 mm×5.0 mm×2.5 mm的小块，按照洋葱自然生长方向放置于培养基①内，每皿约15个。放于(25±2)℃黑暗条件下培养。约7 d后，鳞茎盘开始长出愈伤，约2周后愈伤长成；在超净工作台内用无菌刀片切去老的鳞茎盘部分，留新鲜愈伤，放于新的培养基①内，于(25±2)℃黑暗培养[4]。

晾干水分的洋葱种子，用无菌镊子正放于培养基②内，每皿约25粒。放于(25±2)℃的黑暗条件下培养，约7 d后，种子长出嫩芽，超净工作台内用无菌刀片切去嫩芽，将嫩芽、胚根整齐放于培养基①内，于(25±2)℃黑暗培养。

晾干水分的花苞，用无菌刀片切去花蕾与花柄部分，留花薹，将花薹切成5 mm×5 mm×5 mm的正方体，按照洋葱花薹自然生长方向正放于培养基①内，约7 d后，愈伤开始长出，约2周后愈伤长成；在超净工作台内用无菌刀片切去老的花薹，留新鲜愈伤，放置于新的培养基①内，(25±2)℃黑暗培养。

晾干水分的花蕾，用无菌刀片切去花柄与消毒液接触的表面部分，留花柄约1 cm。将花柄轻插培养基③表面，每皿约20个。放于光照下培养。

2 结果与分析

2.1 洋葱外植体接种培养基的污染率

洋葱外植体接种培养基2～3 d开始出现污染，有真菌或细菌污染，以真菌污染为主，其中灰霉菌最多，其次是绿霉菌。种子和花薹的污染主要为真菌污染(表1)，花薹污染率最低(30%)，种子污染率最高(达75%)。花蕾污染主要是细菌性污染，尤其是培养后期细菌污染率更高。

表1 不同洋葱外植体愈伤诱导的污染率

2.2 洋葱外植体继代培养污染

在洋葱外植体继代培养中，鳞茎盘、花薹在培养基上形成愈伤后，继代培养的污染率在20%；种子未形成愈伤，未进行继代培养。花蕾在培养基中花苞开放，雌蕊膨大，由于花蕾单倍体培养周期长达3月，后期转接污染率在70%。

2.3 洋葱愈伤组织中后期培养污染源位置

继代培养后，由于操作过程中镊子、超净工作台灭菌不彻底，操作者的手带菌等造成的污染，培养基在3～5 d便会有真菌或细菌污染。洋葱组织培养中接种15 d以后开始有污染，90%的污染源位置集中在培养皿的四周，很少有污染源位置在培养皿中间(表2)。细菌性污染非常少，主要为真菌污染，且污染位置集中在外植体放置培养基位点周边空白处，紧贴培养皿边，多为继代培养15 d后出现污染，说明污染源是外部传入，培养基和愈伤组织均未带污染源。推测封口膜(parifilm)在培养过程中开口是导致污染的主要原因，封口膜未进行消毒和灭菌(图1)。

表2 洋葱继代培养15 d后的污染源情况

图1 洋葱愈伤组织污染源位置

3 小结

本实验选择的4种洋葱外植体，以鳞茎盘和花薹愈伤组织诱导率最好，高达100%，而且鳞茎盘和花薹的污染率也较低。本研究发现，继代培养后期由于封口膜漏气或破裂导致污染率较高，由于封口膜无法高压灭菌，故建议采用能够高压灭菌的塑料封口膜，降低污染。在洋葱愈伤组织分化、生根诱导过程中，我们进行了大量配方研究，在分化培养基上可以诱导出大量的根，在光照下根部有叶绿体出现，但均未诱导发芽。后续还需对外植体基因型和诱导激素组合进行大量筛选，以期诱导出洋葱苗，建立稳定的再生体系。