儿童和青少年自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞亚群变化及其临床意义探讨*

吴志敏，杨永煌，卞相丽

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一种进行性炎症性肝病，在10～30岁女性中更为常见[1-3]。AIH的临床特征是血液循环自身抗体，包括抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibody，ASMA)等阳性。另外，AIH患者还表现为血清转氨酶和免疫球蛋白水平升高。在组织学上出现肝再生，肝组织内出现玫瑰花结样改变、汇管区伴有大量淋巴细胞和浆细胞浸润等典型特征[4]。AIH的临床表现可从无明显的症状到轻、重度肝炎，直至暴发性肝衰竭[5]。AIH的病因尚不清楚，可能与遗传易感性、病毒感染或药物应用等因素有关。AIH的易感性与主要组织相容性复合体II相关基因有关，特别是人类白细胞抗原(HLA)基因，包括HLA-DR3、HLA-DR4和HLA-DRB1*1301等[6]。AIH的病理生理学改变涉及淋巴细胞，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等的活化[7]。免疫细胞的激活或功能状态的改变可能导致免疫系统功能失衡，导致细胞因子的产生增加和调节机制紊乱[8]。本研究检测了儿童和青少年AIH患者外周血淋巴细胞亚群的变化，旨在分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2015年6月～2019年1月我院收治的儿童和青少年AIH患者42例，男性14例，女性28例；发病年龄为[9.8(6.5，15.5)]岁。依据2008年国际AIH小组(IAIHG)提出的AIH简化诊断积分系统，即≥7分确诊为AIH[9]；对于怀疑但不能通过简化诊断积分系统确诊的病例，采用1999年IAIHG修正的AIH诊断评分系统诊断，即治疗前≥16或治疗后≥18分的患者被诊断为AIH[1]。排除标准：甲乙丙丁戊型病毒性肝炎、药物性肝损伤、遗传性肝病、巨细胞病毒或EB病毒感染。另选择50例健康儿童和青少年作为健康人，男性20例，女性30例；平均年龄为(10.5±4.7)岁。本研究遵循赫尔辛基宣言的原则，并经我院医学伦理委员会批准通过。所有治疗均获得患儿法定监护人的同意并签署纸质知情同意书。

1.2 外周血淋巴细胞亚群的检测 采集外周静脉血6 ml，采用乙二胺四乙酸抗凝，采用Ficoll密度梯度离心法分离并获得单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。经标记荧光素的单克隆抗体染色，上流式细胞仪检测，获得CD4+、CD8+和CD14+T细胞百分比和不同细胞表面标记物表达百分比。应用抗CD4-APCCy7、抗CD4-Cy7、抗CD8-FITC、抗CD8-APC、抗CD14-FITC、抗CD45RA-FITC、抗CD45RO-PE、抗CTLA4-Cy5、抗CD69-Cy7、抗CD28-PE、抗CD40L-Cy5、抗HLA-DR-Cy7、抗CD95L-PE、抗CD95-Cy5、抗CD25-Cy7、抗CCR3-PE、抗CCR5-Cy5、抗CD80-Cy5和抗CD86-APC。

2 结果

2.1 两组外周血淋巴细胞百分比比较 AIH患者外周血CD4+T细胞百分比显著高于健康人，CD14+T细胞百分比显著低于健康人，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)，而两组外周血CD8+T细胞百分比无显著性差异(P>0.05，表1)。

表1 两组外周血淋巴细胞百分比[%，M(P25，P75)]比较

与健康人比，①P<0.05

2.2 两组外周血淋巴细胞表面标记物表达百分比比较 AIH患者外周血CD4+T淋巴细胞表面CD45RA、CD45RO、CCR3和CD28表达百分比显著高于健康人(P<0.05，表2)；AIH患者外周血CD8+T淋巴细胞表面CD45RA、CCR3和CD25表达百分比显著高于健康人(P<0.05)，CD45R0表达百分比显著低于健康人(P<0.05，表3)； AIH患者其他细胞表面标记物与健康人比较未见显著差异(P>0.05，资料未列出)；AIH患者外周血CD14+T淋巴细胞表面CD45R0表达百分比为 34.7(16.3，57.8)%，显著低于健康人[82.1(73.2，89.7)%，P<0.05]。

表2 两组外周血CD4+T淋巴细胞表面标记物表达百分比[%，M(P25，P75)]比较

与健康人比，①P<0.05

表3 两组外周血CD8+T淋巴细胞表面标记物表达百分比[%，M(P25，P75)]比较

与健康人比，①P<0.05

3 讨论

AIH在世界范围内均有发病，但发病率有种族和地域差异。通过对现有的研究报道进行检索可知，国际上针对AIH报道的研究国家主要来自于日本。长期以来，在国内AIH被认为是较为少见的一类疾病。随着自身抗体检测水平的不断提高及临床医师对该病的认识逐步清晰，现如今国内有关AIH病例报道的研究也在逐年增加。本组AIH患者一般临床资料和实验室检查结果与其他研究结果类似[10-14]。据现有的流行病学研究，AIH在儿童、青少年和女性中相比其他群体发病率更高。AIH可分为急性起病和慢性发病两种形式。自身抗体中以ASMA和ANA阳性最常见。研究表明几乎所有的AIH患者血清丙氨酸氨基转移酶升高，凝血酶原时间延长。

本研究主要探讨了AIH患者外周血CD4+、CD8+T细胞及其免疫表型标记物百分比的变化。与健康儿童和青少年相比，AIH患者外周血CD4+T细胞百分比升高。多项研究已经证明了CD4+T细胞在AIH免疫应答中的作用[15-17]。在AIH组，我们观察到CD14+T细胞百分比相对健康人降低，表明单核细胞的数量和活性增加，免疫调节机制受损。根据T细胞表达CD45分子的类别不同，可将淋巴细胞分为CD45RA+初始T细胞和CD45RO+记忆T细胞。在CD4+T淋巴细胞，AIH患者CD45RA+和CD45RO+均表达增加，提示AIH患者淋巴细胞被慢性和持续性激活。而在CD8+T细胞，AIH和健康人之间的CD45RA+和CD45RO+表达百分比并无显著性差异，提示AIH患者并没有CD8+T细胞记忆标记的激活。CCR3受体属于G蛋白偶联受体超家族，CCR3受体的激活可促进炎症反应，并与活性氧的释放有关。自身免疫状态可能与该受体的高表达存在某种关系[18，19]。测定原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎患者26种趋化因子和细胞因子的血清水平，并与慢性丙型肝炎患者或健康人进行比较，研究结果发现嗜酸性粒细胞趋化因子-3是在血管内皮细胞中产生的一种趋化因子，负责将嗜酸性粒细胞趋化到炎症部位，可以与CCR3相结合，暗示了嗜酸性粒细胞的过敏现象在AHI发病过程中所具有的潜在作用，这可能将嗜酸性粒细胞定义为肝脏特异性过敏性疾病，从而通过阻断这些疾病相关免疫调节剂的作用而开辟潜在的新的治疗途径[20]。与正常人群和慢性肝炎患者相比，AIH患者血清趋化因子-3显著升高，其高度表达似乎是AIH重要的特征，表明了上皮细胞可以在调节病理性T细胞介导的黏膜炎症中发挥作用。在本研究中，可以发现AIH患者CD4+和CD8+T细胞表达CCR3均显著高于健康人。CCR3可能是一个潜在的治疗靶点，对它进行进一步研究具有十分重要的意义。CD28是激活幼稚T细胞、促进T细胞增殖、细胞因子产生和调节长效T细胞存活的主要刺激信号。在我们的研究中，发现CD28在CD4+T细胞表面表达在AIH患者比健康人增加。CD4+T细胞表面CD28表达的增加可能表明AIH患者对皮质类固醇治疗有更好的反应。CD25具有诱导细胞死亡和发挥调节性T细胞和效应性T细胞的作用，被认为是T细胞增殖的重要调节因子。CD25在免疫调节过程中的作用可能依赖于局部炎症环境，后者可能调节细胞表面CD25分子的表达并诱导其在免疫应答反应中的作用。在AIH等活动性疾病患者，调节性T细胞的表达频率较高，并与患者肝脏的炎症活动度相关。研究认为AIH患者循环Treg细胞的频率和功能不会受到影响[15]。也有人报道在自身免疫性肝病患者，Treg细胞频率与患者肝脏疾病活动度参数成反比，并不会受到免疫抑制治疗的影响。真正的Tregs细胞则会产生较少的IL-10，并能够抑制靶细胞的增殖。研究表明在AIH患者调节性T细胞的数量和功能受到了损害。我们观察到AIH患者CD8+T细胞表面CD25+表达明显高于健康人。我们还评估了HLADR的表达情况。HLADR是儿童AIH的易感因素，但很少有研究说明其在细胞表面的表达情况。在本研究，AIH患者HLADR表达较少。有学者在评估患有AIH的儿童和青少年时报道了类似的结果。我们认为HLADR的低水平表达可能导致AIH患者对自身抗原的耐受性减弱。

在本研究中我们探讨了儿童和青少年AIH患者复杂的淋巴细胞免疫表型变化及其意义，AIH患者肝内持续的炎症反应与外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面CCR3、CD45RA/RO、CD25和单核细胞表面的HLADR表达有关，表明细胞水平的免疫系统激活或功能状态的改变，继而引起细胞因子产生增加和调节机制丧失，在AIH的发病过程中发挥着重要的作用。本文未对AIH进行分型，可能影响了观察结果。外周血淋巴细胞表面免疫分子表达的变化及其临床意义还需要进一步研究。