制备大肠杆菌菌蜕的方法比较

袁橙 郭长明 左伟勇 郝福星 左沁丹 蔺辉星

摘要：为进一步研究大肠杆菌菌蜕的制备技术，以pBV221、pCold IV和pETDuet1载体为基础构建了表达噬菌体E基因的溶菌质粒，并利用pETDuet1的2个多克隆位点构建了同时表达E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A的双表达溶菌质粒。经检测，pBV221-E/DH5α组和pCold-E/BL21组的裂解效率最高，但pCold-E/BL21组的裂解起始时间晚于其他几组。诱导剂的浓度对pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）的裂解效率有较大影响。电泳结果显示，随着E基因的表达，细菌DNA逸出膜外，同时金黄色葡萄球菌核酸酶A将DNA降解为250 bp以下的小片段。除pBV221-E/BL21组外，β-丙内酯可实现对其他试验组菌蜕的完全灭活。电镜观察发现，几组菌蜕在结构上并无明显差别。与对照菌相比，菌蜕结构完整，电子密度低且不均匀，细胞膜有不同程度的皱缩。

关键词：菌蜕;大肠杆菌;E基因;金黄色葡萄球菌核酸酶A;裂解效率

中图分类号：S852.5+2文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0410-07

Abstract：In order to further study the preparation technology of bacterial ghosts from Escherichia coli， the bacteriolytic plasmids expressing bacteriophage E gene were constructed based on vectors including pBV221， pCold IV and pETDuet1. Using two polychonal sites of pETDuet1， a double expression plasmid expressing E gene and Staphylococcus aureus nuclease A was constructed. The lysis efficiency of pBV221-E/DH5α group and pCold-E/BL21 group was the highest， but the lysis initiation time of pCold-E/BL21 group was later than other groups. The concentration of inducer had a great influence on the lysis efficiency of pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）. Electrophoresis results showed that with the expression of E gene， bacterial DNA escaped from the cell membrane. Meanwhile， Staphylococcus aureus nuclease A degraded DNA to a small fragment below 250 bp. The β-propiolactone could completely inactivate the bacterial ghost of experimental groups expect pBV221-E/BL21 group. Electron microscopic observation indicated that there was no significant difference in the structure of the bacterial ghost among different groups. Compared with Escherichia coli， the electron density of bacterial ghost was lower and uneven， the cell membrane shrank， and the structure was complete.

Key words：bacterial ghost;Escherichia coli;gene E;Staphylococcus aureus nuclease A;lysis efficiency

1985年，Lubitz等发现噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性菌中表达后能使菌体形成跨膜孔道，细胞质及细胞器等从孔道逸出，形成细菌空壳[1]，这种细菌空壳被称为菌蜕或菌影。与福尔马林灭活细菌疫苗相比，菌蜕的制备过程没有损坏细菌菌体的抗原结构，其免疫原性得到了较好的保留[2-3]，因此可将其作为新型灭活疫苗、疫苗载体或佐剂使用。目前，国内外的相关报道中大都采用E基因单独表达来制备菌蜕[4-7]。也有研究者尝试使用15个柔性氨基酸接头将E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A（SNA）基因串联，通过2个蛋白质在宿主菌中共表达来制备菌蜕[2，8-9]。SNA是一种胞外核酸非专一性磷酸二酯酶，能降解单链或双链DNA或RNA。在菌蜕制备中该蛋白质的表达可将细菌DNA（包括耐药基因和毒素基因）降解为400 bp以下的小片段，从而提高菌蜕使用的安全性[2]。

为研究不同原核表达载体对宿主菌的裂解效率，比较大肠杆菌菌蜕不同制备方法的效果，为大肠杆菌菌蜕疫苗载体和致病性大肠杆菌菌蜕疫苗的研制奠定基础，本研究利用温控型表达载体pBV221、冷休克表达载体pCold IV和双蛋白表达载体pETDuet1构建4种重组质粒用于大肠杆菌菌蜕的制备，对不同制备方法的裂解效率、灭活率等进行比较，同时對双蛋白表达质粒中SNA蛋白对宿主菌DNA的降解效果进行检验，对4种制备方法进行综合评估。

1材料与方法

1.1菌株、载体及试剂

1.1.1菌株大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞购自TaKaRa公司，BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。由于大肠杆菌DH5α菌株无乳糖启动子阻遏蛋白基因lac lq，故不需要异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）。大肠杆菌BL21来源于B株，为Lon蛋白水解酶、ompT外膜蛋白水解酶缺陷型，有利于外源蛋白的稳定表达，可用于pCold I-IV DNA的蛋白质表达。因为BL21宿主不表达T7 RNA聚合酶，所以不适合于启动子为T7的蛋白质表达体系（如pET系列）。BL21（DE3）菌株整合了T7噬菌体基因组，可用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

1.1.2质粒温控型表达载体pBV221、冷休克表达载体pCold IV和双蛋白表达载体pETDuet1由江苏农牧科技职业学院动物流行病学研究中心保存。

1.1.3试剂PCR试剂盒、ClonExpressII One Step克隆试剂盒、胶回收试剂盒、核酸染料GelRed、DL2000 Plus DNA marker等购自南京诺唯赞生物科技有限公司。限制性内切酶和连接酶为赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品。质粒提取试剂盒为爱思进生物技术（杭州）有限公司产品。酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、氨苄青霉素、IPTG等试剂为Sigma-Aldrich公司产品，按照《分子克隆实验指南》[10]中配方制备LB液体、固体培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）等。抗性选择培养基中氨苄青霉素的工作质量浓度为100 mg/L。所用引物由英潍捷基公司合成。

1.24种溶菌质粒的构建

根据NCBI公布的噬菌体PhiX174的裂解基因E碱基序列合成E基因（276 bp）并连接至pUC57载体，命名为pUC57-E。用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pUC57-E和表达载体pBV221，利用T4 DNA连接酶将E基因片段连接至载体pBV221，构建重组质粒pBV221-E。

根据载体pCold IV多克隆位点（Multiple cloning site，MCS）序列和pETDuet1 的第1个MCS序列，分别设计插入E基因片段正/反向PCR引物（见表1）。以pUC57-E为模板扩增，使得PCR产物5′和3′最末端分别带有与线性化载体两末端一致的序列和酶切位点。按照ClonExpressII One Step克隆试剂盒说明书，完成重组质粒pCold IV-E和pETDuet1-E的构建。

根据NCBI公布的SNA序列，合成其无信号肽的膜外区序列453 bp并连接至pUC57载体，命名为pUC57-SNA。根据载体pETDuet1的第2个MCS序列，设计插入SNA基因片段正/反向PCR引物（见表1），按照ClonExpressII One Step克隆试剂盒说明书，完成重组质粒pETDuet1-E-SNA的构建。

将以上重组质粒转化至DH5α，在抗性平板上筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒，通过双酶切和测序对阳性克隆进行进一步鉴定。

1.3运用溶菌质粒制备大肠杆菌菌蜕

参考《分子克隆实验指南》[10]中方法，将上述溶菌质粒转化至适宜的宿主菌。同时将空质粒pBV221、pCold IV和pETDuet1分别转化相应宿主菌作为对照，进行溶菌动力学试验。试验分组见表2。

将pBV221-E/DH5α、pBV221/DH5α、pBV221-E/BL21和pBV221/BL21菌液于28 ℃振荡培養至OD600约为0.5时，取2 ml菌液样品作为诱导前对照，然后将菌液置于42 ℃诱导表达，每隔30 min取样测量OD600值。将pCold IV-E/BL21和pCold IV/BL21菌液于37 ℃振荡培养至OD600约为0.5时，取2 ml菌液样品作为诱导前对照，然后将菌液置于16 ℃，添加IPTG诱导表达，每隔1 h取样测量OD600值。将pETDuet1-E/BL21（DE3）、pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）和pETDuet1/BL21（DE3）菌液于37 ℃振荡培养至OD600约为0.5时，取2 ml菌液样品作为诱导前对照，然后将菌液置于37 ℃，添加IPTG诱导表达，每隔30 min取样测量OD600值。IPTG的诱导浓度见表2。

以上菌液振荡培养至转化有溶菌质粒的菌液OD600值不继续下降时，停止诱导并取2 ml菌液作为诱导后样品。将试验组诱导前菌液样品用生理盐水进行10-4～10-6稀释，诱导停止时菌液样品进行10-1～10-3稀释，每个稀释度涂3块无抗LB平板，37 ℃恒温培养12 h。选取合适稀释度的平板进行计数，取CFU平均值计算裂解率。计算公式为：裂解率=（1-诱导后CFU/诱导前CFU）×100%[11]。

1.4SNA蛋白对宿主菌DNA的降解作用检测

取方法1.3中pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）诱导前（0 h）和诱导后（2 h）的菌液样品各1 ml瞬时离心，移取上清液备用。菌体沉淀用煮沸裂解法提取DNA[12]：将沉淀溶于100 μl PBS（pH7.4），进行沸水浴（10 min）和冰浴（5 min），12 000 g离心10 min取上清液。取样品5 μl通过1%琼脂糖凝胶电泳分析SNA蛋白对细菌DNA的降解活性。同时制备pETDuet1-E/BL21（DE3）诱导后（2 h）的菌液样品作为对照。

1.5菌蜕的灭活

菌液停止诱导后，向菌蜕溶液中加入β-丙内酯至终体积分数为0.025%，并置于42 ℃作用1 h，离心菌液收集菌体沉淀，沉淀用灭菌PBS（pH7.4）溶液清洗3遍后重悬，加入β-丙内酯至终体积分数为0.05%，再置于42 ℃作用2 h。分别取灭活后的菌蜕溶液涂板进行无菌检验。

1.6透射电镜观察菌蜕

用负染色方法对灭活后的大肠杆菌菌蜕pBV221-E/DH5α、pBV221-E/BL21、pCold IV-E/BL21、pETDuet1-E/BL21（DE3）和pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）进行染色。同时培养转化有不同空载体的宿主菌作为对照样品。透射电镜观察样品的制备方法为：将铜网置于不干胶底纸上，向铜网上滴加一滴大肠杆菌菌液，静置10 min后用滤纸吸取菌液，再向铜网上滴加一滴2%磷钨酸染液，染色1 min后吸去染液，置于红外烘灯下处理10 min。使用Philips透射电子显微镜（Tecnai 12）观察菌体结构。

2结果

2.1溶菌质粒的构建

重组质粒双酶切结果显示重组质粒pBV221-E、pCold IV-E和pETDuet1-E中的插入基因片段长度与E基因长度一致（图1）。重组质粒pETDuet1-E-SNA中第2个MCS位点中的插入基因片段长度与SNA基因长度一致。依据质粒测序结果选择插入基因片段序列完全正确的克隆用于后续试验。

2.2宿主菌的生长曲线

通过检测发现，在诱导30 min内，pBV221-E/DH5α菌液OD600即开始下降，在诱导150 min后数值趋于稳定，约为0.30（图2A）。在诱导30 min后，pBV221-E/BL21菌液OD600开始下降，在诱导120 min后达到最低，约为0.55（图2A）。pCold-E/BL21菌液OD600在E蛋白诱导表达2 h后开始下降，诱导4 h后数值趋于稳定，约为0.30（图2B）。当IPTG终浓度为0.5 mmol/L时，pETDuet1-E/BL21（DE3）菌液OD600在诱导30 min内开始下降，90 min后停止下降，約为0.20。pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）菌液在诱导30 min后开始下降，120 min后达到最低值，约0.30（图2C）。当提高IPTG终浓度至1.5 mmol/L时，pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）菌液OD600的下降时间晚于0.5 mmol/L和1.0 mmol/L诱导组（图2D）。与此同时，转化有空载体的各对照菌液的OD600一直保持上升趋势（图2）。

2.3溶菌质粒的裂解效率

经计算，得到不同菌蜕制备方法的裂解效率（表2）。表2显示，pBV221-E溶菌质粒对DH5α和pCold IV-E溶菌质粒对BL21的裂解效率均较高，可达99.99%。而pBV221-E对BL21的裂解效率最低，为12.00%。pETDuet1-E-SNA对BL21（DE3）的裂解效率受IPTG浓度的影响，在IPTG浓度为1.0 mmol/L时裂解效率较高，为90.44%。

2.4SNA蛋白对宿主菌DNA的降解作用

IPTG诱导后0 h，pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）细菌培养上清液中未见明显的基因组条带，而同时间点的细菌裂解物中可见大片段基因组条带（图3）。在E蛋白对菌膜打孔的作用下细菌DNA渗出，诱导后2 h的pETDuet1-E/BL21（DE3）DNA样品中无基因组条带，而诱导后2 h的pETDuet1-E/BL21（DE3）细菌培养上清液样品中出现未被降解的基因组条带（图3）。经IPTG诱导后2 h，在SNA蛋白的作用下，pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）细菌DNA被降解，诱导后细菌培养上清液和细菌裂解物中均未出现大片段基因组条带，仅有约100 bp左右的条带（图3）。

2.5不同方法制备的大肠杆菌菌蜕灭活效果

通过涂板检验发现，经β-丙内酯灭活处理后pBV221-E/BL21菌蜕溶液中仍有活菌存在，而pBV221-E/DH5α、pCold-E/BL21、pETDuet1-E/BL21（DE3）和pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）4种菌蜕溶液中无活菌。

2.6大肠杆菌菌蜕的结构

透射电镜观察，结果（图4）显示，对照菌结构完整，菌体电子密度较高且分布均匀，而几种菌蜕的电子密度明显降低且分布不均，细胞膜出现不同程度的皱缩变形，对照菌和菌蜕样品均未见鞭毛结构。

3讨论

目前，已报道的大肠杆菌菌蜕的制备方法较多，其中大多数方法均利用了噬菌体E基因在大肠杆菌中的表达。有研究者尝试利用细胞穿透肽在大肠杆菌中的表达来制备菌蜕，未能获得成功[8]。另有研究者将E和SNA串联表达，同时实现了细菌的高效裂解和基因组DNA的降解。这些研究中，被用于E基因表达的载体包括pBV220、pBV221、pBAD、pET32a、pML1、pDKL01等。这些载体中，除pBAD外，均不能实现2个以上蛋白质的共表达。被用于表达的大肠杆菌中既有致病菌又有工程菌，如E.coli pop 2135、E.coli O157∶H7、禽致病性大肠杆菌APEC1（O45）、CH2（O78）、O78K80，以及工程菌TOP10、JN10、DH5α和BL21（DE3）等[11，13-15]。人们在将获得的菌蜕作为菌苗的研究中，往往选择致病菌作为表达菌，而在将菌蜕作为核酸或重组蛋白载体的研究中，一般选择工程菌用于菌蜕制备。本研究中创新性地将pCold IV冷休克表达载体和pETDuet1双表达载体运用于大肠杆菌菌蜕制备，并与pBV221载体制备方法进行综合比较。

研究中发现，不同菌蜕制备方法中的宿主菌裂解效率有较大差别。pBV221-E溶菌质粒对DH5α和pCold IV-E溶菌质粒对BL21的裂解效率较高，达99.99%。而pBV221-E对BL21的裂解效率最低，且相同灭活条件下不能实现对菌蜕的完全灭活。这提示我们将pBV221-E用于不同来源宿主菌的菌蜕制备时，裂解效率有较大差异。pCold系列载体属于大肠杆菌冷休克表达载体，可在低温下诱导目的蛋白的表达，提高表达产物的溶解性和稳定性[16]。在本研究中pCold IV-E的裂解效率接近100%，但其缺点是需要较长的诱导表达时间。前期试验中，pETDuet1-E-SNA组IPTG终浓度为常用的0.5 mmol/L，但细菌裂解效率仅为50%，明显低于pETDuet1-E组。在后续试验中将IPTG诱导浓度提高为1.0 mmol/L和1.5 mmol/L后发现，当IPTG终浓度为1.0 mmol/L时，该质粒对宿主菌的裂解效率优于0.5 mmol/L和1.5 mmol/L组，为90.44%。我们推测，这是因为不同诱导剂浓度对E蛋白和SNA蛋白的共表达具有较大影响，从而影响了蛋白质对宿主菌的裂解作用。从宿主菌生长曲线中可以看出，pCold IV-E/BL21的OD600值下降时间晚于其他组。这可能是因为pCold IV属于低温诱导表达载体，其适宜的表达温度为16 ℃，而细菌在此温度下增殖速度较慢，E蛋白表达速度也受到影响。本研究中，其他菌蜕制备组的OD600值下降时间均为30 min前后，且在诱导约90～120 min后趋于稳定。这2个时间点早于国内外的部分报道[2，11，17]，提示这几种方法在生产周期上可能有一定优势。

值得注意的是，虽然不同制备方法的裂解效率有较大差异，但是除pBV221-E/BL21外，其他试验组均能实现β-丙内酯处理下的100%灭活。提示裂解效率达到一定的数值后，裂解效率的高低将不会对β-丙内酯的灭活效果产生影响。与常用的甲醛灭活剂相比，β-丙内酯不直接作用于蛋白质，而是作用于病原体DNA或RNA，因此能保持病原良好的免疫原性，且作用时间短，易水解无残留，不会引发严重的接种反应[18]。如果从降低生产成本的角度考虑，pBV221-E/DH5α方法不需添加诱导剂，通过提高培养温度即可完成细菌裂解，有显著优势。如果从提高安全性的角度考虑，虽然pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）（IPTG 1.0 mmol/L）组的裂解效率不是最高，但该方法可实现细菌DNA的降解，因此理论上获得的菌蜕产品的安全性更好。这与国内一些学者的研究结果一致[2，19]。同时，pETDuet1还可与pACYCDuet1双表达载体联合使用，在合适的宿主菌中实现4个基因的共表达，在菌蜕制备的同时实现其他外源基因的表达，进一步拓展菌蜕的功能。同时值得注意的是，pET系列载体的表达需要使用融合有T7噬菌体RNA聚合酶的宿主菌[20]，这在一定程度上限制了该载体的使用。

通过电镜观察发现，不同方法获得的菌蜕均能保持较为完整的细菌形态，但是未观察到鞭毛结构。这提示如果将溶菌质粒转入禽致病性大肠杆菌分离株进行菌蜕制备，获得的菌蜕可能具有更好的免疫原性，更适合作为菌苗使用[14，21]。而利用DH5α、BL21和BL21（DE3）等工程菌制備的菌蜕因宿主菌来源清晰，可用于核酸疫苗和亚单位疫苗等疫苗菌蜕载体的制备。

综上所述，与溶菌质粒pCold IV-E和pETDuet1-E相比，pBV221-E和pETDuet1-E-SNA在未来的生产和应用中更具潜力。我们将在本研究的基础上对溶菌质粒进行改造，继续开展将细菌菌蜕作为新型疫苗递送系统的研究。

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（责任编辑：张震林）