食品微生物检验检测方法研究进展

2020-05-26宋爽

食品安全导刊·下旬刊 2020年2期

摘要：随着科技的迅速发展，尤其是生物学技术方面，我国的食品检验技术也逐步从传统培养转入分子等先进技术方向。本文就近些年新的技术方法的概念、原理、特点进行阐述，为建立食品微生物更高效的检验检测系统奠定基础。

关键词：食品微生物；检验检测；分子生物学技术

如今，信息科技的发展，不仅便利了生活，也让人们面对的问题越来越多，比如三聚氰胺奶粉案。食品的安全问题已成为现在人们关注的焦点，做好食品安全检测尤为重要。而在食品检验检测中，通常微生物的检验过程是尤为繁杂的。由于微生物的种类繁多，每一种微生物的生存环境不一样，这给检验工作带来很大压力。目前，已有很多省时省力的检测方法出现，下面就对现在微生物检测的前沿技术进行阐述。

1 分子生物学技术

1.1 PCR技术

PCR是一种扩增DNA片段的分子技术，由于菌体中的一些基因保守性很强，因此可扩增其相应的保守序列，来准确、快速地检测菌体。具有操作便捷、检测快捷、准确率高、灵敏度高与目标特异性强的特点，在微生物检验检测过程中得以广泛应用。目前该方法已被应用在乳制品中双歧杆菌、乳酸菌及酵母菌的检测中，且能对沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺杆菌、单核细胞李斯特菌与金黄色葡萄球菌等致病菌进行有效测定[1]。

PCR技术还可与新技术结合，形成新的PCR衍生技术。例如，qRTPCR、Multiplex PCR以及PCR-DGGE和LAMP等。其中，qRT-PCR，即实时荧光PCR技术，相对于传统的PCR技术而言，具有更强的特异性、更高的自动化程度，且不易污染，近年来已在多种致病细菌、霉菌、酵母菌母以及乳酸菌等重要食品微生物指标的定性和定量检测中广泛应用。PCRDGGE，则是PCR与变性梯度凝胶电泳分析技术相结合，形成的一项新技术方法。该方法是通过选择电泳条件，根据DNA片段中的碱基差异区分微生物。该技术可用于不可培养型细菌的检测，具有高检测率以及高重复性特点，目前该项技术已被广泛应用在发酵类食品以及酒类等的检验和研究中。Multiplex PCR多被应用在食品病原微生物检测中，其中可检测出肉类中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157∶H7[2]。LAMP利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链的合成，结果在同一链会形成有很多环的结构的茎—环DNA混合物，反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断。在大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌与金黄色葡萄球菌中已有广泛应用[3]。

1.2 基因芯片

基因芯片技术是将带有寡核苷酸的芯片与样品DNA经PCR扩增后制备的荧光标记探针杂交，通过扫描仪分析荧光分布模式来确定样品中是否存在特异微生物，具有检验范围广、操作快速、特异性强的特点，有广泛的应用前景。例如，何洋[4]建立了一种利用基因芯片快速检测鉴定食品中金黄色葡萄球菌的技术，过程仅需7 h，且实用性、特异性和稳定性很强。

1.3 核酸探针

核酸探针是指带有标记的特异DNA片段，通过碱基互补与目的DNA杂交，再用特定的方法测定标记物，来判断特异性微生物是否存在。该方法包含放射性标记、非放射性标记。放射性标记核酸探針的特异性非常强；而非放射性标记的类型多，有荧光素标记、生物素标记、免疫标记与地高辛标记等，具有直观、准确等特点。核酸探针技术主要用于食品中致病性病原菌的检测。例如，生物素-抗生物素蛋白系统标记的探针[5]已在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒检测中应用。

2 免疫学技术

2.1 免疫荧光

免疫荧光技术是在特异性抗体（或抗原）上标记荧光色素，然后与待检样品中微生物的相应抗原（或抗体）结合，通过荧光显微镜检测特异性荧光反应，以达到检测相应微生物的目的。该技术的主要特点是特异性强、敏感性高、速度快。目前，可用来对沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E-Coli O157和单核细胞增生李斯特氏菌等进行快速检测[6]。

2.2 酶联免疫

酶联免疫吸附技术是通过固相载体将抗原或抗体吸附于表面，而后进行免疫酶染色，再进行底物显色，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中是否存在特异微生物。该方法具有反应灵敏、标记物稳定、适用范围广、结果判断准确以及费用低等特点。例如，王静[7]等利用其检测肠出血性大肠杆菌，可在40 min内完成。

酶联免疫结合免疫荧光技术形成一种新的检测技术叫酶联荧光免疫检测，该方法大大提高了检测效率。例如，陈思强[8]等采用自动酶联荧光免疫分析系统对冻肉中沙门氏菌进行检测，大大提高了检验效率。

2.3 免疫层析

免疫层析是将待测物与条状纤维膜上一定区域的配体结合，通过毛细管使样品在条状纤维膜上泳动，而后进行酶促显色反应或直接使用着色标记物，以达到检测特异微生物的目的。按原理可分为两类，一类以酶促反应显色为基础，以显色度来定量；另一类则使用着色标记物如乳胶颗粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等进行检测。例如，杜邦的大肠杆菌O157： H7、沙门氏菌、李斯特菌等检测试纸条，检测金黄色葡萄球菌的Aureus Test试剂盒都是基于免疫层析技术的产品。

2.4 免疫磁珠

免疫磁珠法是在磁性颗粒表面偶联特异性抗体，并与样品中被检微生物中的特定抗原发生特异性结合，通过磁场作用于载有微生物的磁性颗粒，使微生物可得到特异性分离、浓集。该方法使食品检测更加快速、高效，且具有可重复性。据报道，可以通过该种技术来完成对大肠杆菌0111、0145、0157以及沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的检测和鉴定。

2.5 免疫扩散

免疫扩散是指特异性抗原与相应抗体在琼脂介质中扩散、结合，在适当比例处形成沉淀线，根据沉淀线生物有无、形状、位置等进行抗原（抗体）定性及定量分析。其介质多种多样，例如琼脂、明胶、果胶与聚丙烯酰胺等，适用范围广，目前广泛应用于病原微生物检测中。

2.6 免疫印迹

免疫印迹是根据抗原抗体特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白（特有的），能够对特异性抗原（抗体）进行定性、定量分析。该技术融合了SDSPAGE的高分辨率及酶联免疫技术的高敏感性和高特异性，是一种准确、高效的分析手段，已被广泛应用于检测酵母、真菌及疾病的诊断中。

3 生理生化技术

3.1 传统代谢组学技术

3.1.1 电阻抗法

由于微生物在生长过程中可代谢导电性弱的大分子底物，使之变成导电性强的小分子底物，使培养基的电导性增强，培养物的阻抗降低，形成特征性阻抗曲线，电阻抗法即利用这一特性达到鉴定微生物的目的。该方法具有特异性、快速反应性、高敏感性和高重复性等特点。目前，该法已被广泛应用于食品中细菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酵母菌和商业无菌的检测[9]。

3.1.2 微热量计法

微生物在生长过程中会产生热量，利用微热量计测量特征性微生物的产热量等特异性数据，绘制成时间与产热量对比组成的热曲线图，将所有特征性微生物的热曲圖综合后形成图库。待测微生物的热曲线图与已知细菌热曲线图直观比较，即可对微生物进行鉴别。该方法操作便捷、检测效率高、应用范围广。例如，美国TA公司的TAM Ⅲ系统就是基于该原理对菌体进行鉴别的。

3.1.3 微量生化法

微量生化法是通过对菌体生长过程中生化特性变化的检测，以鉴定菌体。该方法具有简单、快速、可靠等特点。目前已有多种高精密度和高重现性的微生物鉴定用试剂盒，例如，MICRO-ID可用于检测李斯特氏菌；API用其独特的数值鉴定法可鉴定15个系列、600多种细菌。

3.1.4 放射测量技术

放射测量技术是将培养基中的碳水化合物或盐类等底物分子，引入放射性14C标记，通过微生物代谢碳水化合物或底物后，释放出含放射性的14CO2，再用自动化放射测定仪测量14CO2的含量，以达到检测微生物的目的。该方法具有快速、准确等优点。在测定食品中的细菌得以广泛应用，如常用的Bactec MGIT 960系统[10]。

3.1.5 接触酶测量技术

接触酶测量是在装有H202的试管中，放置一个含有接触酶的纸盘，通过计算纸盘漂浮的时间来对微生物进行合理预估。纸盘上浮时间短，说明接触酶含量高；反之，接触酶含量低。自然界中大多数腐败微生物是嗜冷性细菌，而大多数嗜冷细菌的接触酶呈阳性，因此该方法可以应用于检测食品中的腐败微生物。

3.1.6 快速酶触反应技术

快速酶触反应技术是根据特异性微生物在生长繁殖过程中可合成或释放特异性酶的原理进行检测，选用与特异性酶的特性相适应的底物或指示剂进行反应，以此鉴定微生物。该方法应用范围较广。例如，Biolog微生物鉴定系统[11]是根据微生物对95种不同碳源代谢率的特异性差别，并与标准菌株对比进行鉴定。

3.2 生物传感器技术

3.2.1 光学传感器

光学传感器是在培养基中预加指示剂后，微生物代谢的特异性产物与指示剂反应后，会使培养基颜色发生变化，这种颜色变化再由光学检测器检测、计算，得出特征性数据，以达到检测微生物的目的。这种方法简便、快速、成本较低，但只适用于检测能产生荧光素的细菌，且灵敏度不高。例如，梅里BacT/Alert微生物检测仪、NHD公司的手持式大肠类细菌快速检测系统和BioLumix公司的实时微生物快速荧光光电检测仪，都是基于此原理进行检测的。

3.2.2 生物发光传感器

ATP生物发光法是由生物体内的ATP和荧光素酶催化荧光素与氧结合，荧光素分子中的电子跃迁发出荧光，而在一定范围内，荧光浓度与ATP浓度呈线性关系，可通过光度计对荧光素的荧光强度来检测菌体的数量。从应用实践来看，该技术具有省时、简便性，多应用在大量食品样本的检测、现场检测等领域。自动ATP生物荧光技术已广泛应用于乳制品工业中，如生乳活菌数检测、设备清洁度的评估及成品架售期的推算等。

3.2.3 电化学传感器

电化学传感器是微生物通过利用低电导率的大分子物质进行新陈代谢，生成高电导率的小分子物质，使培养基的电导率发生变化，再以电信号的变化检测微生物。此技术特点是成本低，效率高。该技术被广泛应用于食品微生物检测，例如，微生物自动快速检测系Bac- Trac4300，在检测中没有出现假阴性结果。

3.2.4 免疫传感器

免疫传感器是结合免疫学与传感器的新技术，在结构上由生物敏感元件、信号转换器和信号数据处理器3部分构成。当待测微生物的特异性分子与识别元件特异性结合后，产生的复合物可通过信号转换器转变为可以输出的电信号或光信号，并通过信号数据处理器进行分析，以达到检测的目的。该方法应用范围较广。据报道，采用电化学免疫传感器技术检测大肠杆菌O157∶H7，可以在10 min内完成[12]。

4 快速测试片

快速测试片是将特定的培养基和显色物质附着在纸片、纸膜、胶片等载体上，通过微生物的生长过程中产生的特异性产物、并显出特异性颜色来检测食品中微生物。该方法具有显著的优点：操作简便，易于保存、运输，减少对环境的污染、试验前准备工作以及试验后的清洗工作。近年来以滤纸、美国3M公司的Petrifilm和无纺布为载体的测试片，在检测菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等菌体时，具有操作简便且检出率较高的特点，且与传统方法相比在统计学上无显著差异，现已开始被广泛应用[13]。

5 分析化学技术

现已有很多仪器分析方法，如高效液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱仪以及液相色谱-质谱仪等，在食品微生物检测鉴定中广泛应用[14]。这些方法是通过分析微生物的化学组分进行鉴定的，是一种新型微生物检测手段。目前，应用和研究最多的是气相色谱技术。该方法首先是通过微生物裂解；其次，用甲醇分解、提取化学组分；再进行硅烷化、甲基化等衍生化处理，使特异性化学组分分离，并进行数据分析、建立标准色谱图库，将待鉴定微生物谱图与标准谱图相比较，来鉴定微生物[15]。该技术可应用于海产品腐败菌的快速检验、革兰氏阳性菌的检测、发酵型食品的菌种检验、动物源双歧杆菌亚种的分类鉴定等[16]。

6 结语

目前我国食品安全问题较为突出，而控制食品安全的首要措施是提高监测手段，因此，快速筛查技术在未来会有良好的研究价值和应用前景。而微生物快速筛查技术经过了长期探究及发展，已经进入快速、灵敏且仪器化的发展阶段。但是，由于我国对该技术的研究起步晚、发展速度慢，该技术水平急需提升。各类学科技术的相互交叉、融合，以及降低先进技术的成本是未来科研工作者的研究重点。

参考文献

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