CygoSTK基因在普通春兰与奇花品种‘天彭牡丹’中的表达比较

夏胜应 刘志雄

摘 要： 为深入研究春兰 （Cymbidium goeringii） 与春兰奇花品种花器官发育调控的分子机制，该研究采用同源克隆的方法，分别从普通的春兰与春兰奇花品种‘天彭牡丹的花芽中克隆得到1个cDNA长849 bp D类MADS-box基因CygoSTK（Genbank 登录号为MH917912.1）。结果表明：该基因序列在两种春兰中高度一致，包含1个长705 bp的完整ORF，编码1个由234个氨基酸残基组成的STK进化系MADS-box转录因子;结构分析表明，CygoSTK转录因子包含1个高度保守的MADS结构域（MADS domain）（1～57）和1个次级保守的K结构域（91～172），其C末端的转录激活区含有两个高度保守的基序，即AGI基序和AGⅡ基序;进一步用qPCR检测CygoSTK基因在普通的春兰与春兰奇花品种‘天彭牡丹不同花器官中的相对表达量发现，CygoSTK基因在普通的春兰和春兰‘天彭牡丹子房中的表达量最高，显著高于该基因在相应品种其他花器官中的表达量（LSD，P<0.05）。以上结果说明CygoSTK基因在功能上有很强的保守性，主要参与春兰子房的发育。

关键词： 春兰， CygoSTK基因， MADS-box， 花发育， 实时荧光定量

中图分类号： Q943.2  文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2020）04-0518-08

Abstract： In order to uncover the molecular mechanism of flower organ development regulation of Cymbidium goeringii and varieties with abnormal flower， a cDNA was cloned from the flower buds of the common C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan by homologous cloning method. The 849 bp D-class MADS-box gene CygoSTK （Genbank accession number is MH917912.1）， which was high identity in C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan， contained a 705 bp complete ORF， encoding 234 amino acid residues; Protein alignment and a phylogenetic tree grouped CygoSTK into the STK lineage. Structural analysis showed that CygoSTK transcription factor contained a highly conserved MADS domain （1-57） and a secondary conserved K domain （91-172）; In addition， the C-terminal transcriptional activation region of CygoSTK contained two highly conserved motifs： AGI motif and AGⅡ motif. Furthermore， the relative expression of CygoSTK gene in different floral organs of C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan was detected by qPCR. Our data suggested that CygoSTK expression was the highest in the ovary of common C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan， which was significantly higher than that of the other floral organs （LSD，P<0.05）. Our results indicate that the function of CygoSTK gene is highly conserved and CygoSTK is mainly involved in regulating the ovary development of C. goeringii.

Key words： Cymbidium goeringii， CygoSTK gene， MADS-box， ploral development， real-time quantitative PCR

春蘭（Cymbidium goeringii）是兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）地生兰类植物，又名朵兰、扑地兰、幽兰、朵朵香、草兰，在我国有两千多年的栽培历史，因其资源稀有和花型独特而成为人们最为喜欢的国兰种类之一，是春兰育种的重要方向（Xiang et al.， 2018）。普通（野生）春兰主要分布在我国的长江流域及西南地区，日本和朝鲜半岛也均有分布（陈君梅等，2016）。春兰叶片飘逸、花姿高雅、花色素淡、香气清幽，具有较高的观赏价值和经济价值，深受东南亚人们的喜爱（Zuo et al.， 2017 ; Han et al.， 2018）。我国春兰栽培历史悠久，自然变异类型丰富，积累了许多以花色、瓣型、花型、叶艺等形色各异的名贵种质资源，形成了深厚的养兰、赏兰文化。开发和选育观赏价值高的春兰新品种，对于丰富我国春兰种质资源，弘扬和传播国兰文化等具有重要的科学意义和经济价值。

在春兰传统铭品中，春兰‘天彭牡丹作为牡丹型奇花的代表，其唇瓣增多，合蕊柱无药帽，由于其开花后酷似牡丹而备受国人青睐。前人对兰科（Orchidaceae）植物意大利红门兰（Orchis italica）的研究发现，其SEEDSTICK（STK）同源基因OitaSTK对维持合蕊柱、胚珠和唇瓣形态的正常发育有重要作用（Salemme et al.， 2013）。在拟南芥中，STK是参与调控胚珠和种子正常发育的D类MADS-box基因，主要在胚珠和种子中表达（Hundertmark et al.， 2008）。研究春兰花器官发育的STK基因的表达模式和功能，一方面有助于解析春兰花器官形态建成分子基础，为春兰的花型改良和分子育种积累基因资源;另一方面为研究兰科植物的花型演变积累资料。本研究以普通（野生）春兰（Cymbidium goeringii）与春兰奇花品种‘天彭牡丹（C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan）为材料，在克隆其D类MADS-box基因CygoSTK的基础上，通过比较该基因在两个春兰品种花器官中表达模式的差异，分析该基因的表达差异与花型变异的相互关系，以期解析CygoSTK基因参与春兰花发育调控的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

普通（野生）春兰（Cymbidium goeringii）与春兰奇花品种‘天彭牡丹（C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan）引种后种植于湖北荆州长江大学园艺园林学院人工气候室。于2018年1月份分别取其当天开花的花朵，分别剥取春兰的花萼、花瓣、唇瓣、花粉块、合蕊柱和子房和‘天彭牡丹的花萼、花瓣、唇瓣、合蕊柱和子房。将其按组织分开，取样后迅速放于液氮中速冻，于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 研究方法

1.2.1 春兰RNA的分离和第一链cDNA合成 采用EASY spin Plus多糖多酚复杂植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）分别提取春兰与春兰‘天彭牡丹花芽的总RNA，用M-MLV逆转录酶（TaKaRa）合成第一链cDNA，反应体系和操作按照说明书进行。

1.2.2 春蘭CygoSTK基因的克隆 根据Genbank中已公布的兰科植物STK同源基因的5′非翻译区（5′ untranslation region， 5′UTR）和3′UTR的保守序列设计春兰STK同源基因引物（表1），进行春兰STK同源基因的全长扩增，扩增程序和阳性克隆的鉴定参考刘志雄和于先泥（2012）的方法。引物合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.3 CygoSTK基因序列结构分析 将分离得到的春兰CygoSTK基因完整开放阅读框（Open Reading Frame， ORF）编码的蛋白在NCBI网页上执行BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源搜索比对，选取来自不同被子植物的20个STK同源蛋白（表2），采用MEGA5.0软件的邻接法（NJ）构建蛋白序列的分子系统发育树。同时，选取拟南芥（Arabidopsis thaliana）的STK、矮牵牛（Petunia×hybrida）的FBP7、FBP11和球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）等8个物种的9个STK同源蛋白（表3），用BioEdit 7.2软件中的ClustalW程序进行序列比对，进一步分析CygoSTK蛋白的结构域。

1.2.4 CygoSTK基因的表达分析 在CygoSTK基因的非保守区域中设计引物，并以春兰的CygoActin（GU181354.1）为内参基因，设计内参基因引物，检测引物的特异性后，用实时荧光定量PCR技术（quantitative real time PCR，qPCR）检测CygoSTK基因在春兰不同花器官中表达的组织特异性，引物序列见表1。qPCR在CFX96（BIO-RAD，美国）荧光定量PCR仪上进行，反应体系20 μL：ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL;上、下游引物各0.4 μL;cDNA模板0.4 μL;ddH2O 8.6 μL。反应程序：95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 15 s;40个循环。实时荧光定量采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒（购置于南京诺维赞生物科技有限公司），基因的相对表达量按照2-△△Ct法计算。用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 两种春兰花结构的分析

普通春兰的花由3枚花萼、2枚花瓣、1枚特化的唇瓣、2个花药构成的花粉块、1个合蕊柱和1个由3心皮合生的子房组成，其中花粉块着生于合蕊柱上（图1：A）。春兰‘天彭牡丹的花结构包括4个花萼、花瓣2至多数、唇瓣2至多数、合蕊柱顶端无花粉块，子房外观形态正常（图1：B）。

2.2 春兰CygoSTK基因全长cDNA序列的克隆

春兰CygoSTK基因cDNA序列全长849 bp，包含1个长111 bp的5′UTR，1个长705 bp的ORF，编码1个含234个氨基酸残基的STK-like转录因子和1个终止密码子，同时该序列还包含1个长33 bp的3′非翻译区。命名为CygoSTK（Genbank登录号为MH917912.1）。序列结构分析表明，两个品种中克隆得到的CygoSTK基因碱基序列完全一致。

2.3 蛋白同源序列比对与分子系统发生分析

分子系统发生分析与进化树重建结果（图2）表明，CygoSTK转录因子与9个被子植物共10个STK同源蛋白共聚于STK进化系， 是拟南芥STK直系同源蛋白，其与拟南芥的STK转录因子的序列相似性为57.87%，该转录因子与单子叶植物的STK同源蛋白聚于1个小的进化分支，其与兰科植物球花石斛STK同源蛋白DthyrAG2的亲缘关系最近，序列相似性高达88.46%，物种间的演化关系在进化树上得到了很好支持。

蛋白同源序列比对结果（图3）显示，CygoSTK转录因子具有1个高度保守的MADS结构域（MADS domain）（1～57），1个次级保守的K结构域（91～172），1个保守性较低的I区（58～90）。其M区有57个氨基酸，I区有33个氨基酸，K区有82个氨基酸，C区有62个氨基酸，其C末端的转录激活区含有两个高度保守的基序，即AGI基序和AGⅡ基序，且在该蛋白的最末端发现了单子叶植物D类蛋白特有的MD基序（图3）。这进一步证实CygoSTK蛋白属于MADS-box基因家族中的D类蛋白。

2.4 春兰CygoSTK基因在花器官中表达的组织特异性分析

qPCR检测分析结果（图4）显示，在春兰中CygoSTK基因主要在花瓣、唇瓣、花粉团、合蕊柱和 A. 春兰; B. 春兰‘天彭牡丹。

子房中表达，在花萼中仅能检测到微弱的转录信号;其在子房中的表达量最高，均显著高于其在其他花器官中的表达（LSD，P<0.05），在合蕊柱中的表达量其次，但均显著高于其在花瓣、唇瓣和花粉团中的表达量（LSD， P<0.05）;同时，CygoSTK基因在唇瓣中的表达量显著高于花瓣和花粉团（LSD，P<0.05），但其在花粉团中的表达与花瓣中的表达量却无显著差异。在春兰‘天彭牡丹中CygoSTK基因主要在花萼、唇瓣、合蕊柱和子房中表达，在花瓣中仅能检测到微弱的转录信号;与普通春兰类似，CygoSTK基因在春兰‘天彭牡丹子房中的表达量最高，均显著高于其他花器官（LSD，P<0.05），在合蕊柱中的表达量次之，显著高于花萼和唇瓣（LSD，P<0.05），同时在花萼中的表达量也显著高于唇瓣（LSD，P<0.05）。从CygoSTK基因在两种春兰同类花器官表达的差异来看，CygoSTK基因在春兰‘天彭牡丹的花萼中有明显表达，而在普通春兰花萼中仅能检测到微弱的转录信号;在普通春兰的花瓣中有明显表达，而在春兰‘天彭牡丹花瓣中仅能检测到微弱的转录信号;但CygoSTK基因在普通春兰唇瓣中的表达量却显著高于春兰‘天彭牡丹（LSD，P<0.05）。从CygoSTK基因在普通春兰和春兰‘天彭牡丹合蕊柱与子房中的表达量来看，CygoSTK基因在普通春兰子房中的表达量显著高于‘天彭牡丹（LSD，P<0.05），但在两个品种合蕊柱中的表达量却无显著性差异。

3 讨论

在本研究中，获得了春兰与春兰奇花品种‘天彭牡丹花器官发育相关的1个MADS-box基因CygoSTK。氨基酸序列比对、蛋白质结构域和系统进化树分析结果表明，CygoSTK蛋白均含有典型的MADS结构域和K结构域，是高度保守的D类MADS-box蛋白。

在被子植物中，MADS-box基因表达模式的变化大多会对植物的生长发育产生重要影响（Kramer et al.， 2004）。在模式植物拟南芥中，STK基因主要在子房中表达，参与调控胚珠和种子的发育（Hundertmark et al.， 2008）。在石蒜科（Amaryllidaceae）植物中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）中，STK-like基因NtSTK主要在雌蕊中表达（吴菁华等，2015）。在蔷薇科（Rosaceae）植物重瓣樱花‘普贤像中，STK同源基因PrseSTK在花萼、雄蕊和雌蕊中表達，其在花萼中异位表达导致重瓣樱花萼筒上着生异位子房，进而参与调控樱花单瓣与重瓣花的形态差异（刘志雄和李凤兰，2015）。在棕榈科植物油棕（Elaeis guineensis）中，其STK同源基因SHELL除参与调控果实形状发育外，还参与种子油脂的合成（Singh et al.， 2013）。在兰科植物中，文心兰（Erycina pusilla）的STK同源基因EpMADS23在合蕊柱中的表达量显著高于其他花器官组织（Dirks-Mulder et al.， 2017）。在小屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）中，STK-like基因PeMADS7仅在合蕊柱中表达，且表达时间相对较晚，PeMADS7转基因拟南芥表现出早花、叶片向上弯曲以及种子不育增加等现象（You et al.， 2012）。木石斛（Dendrobium crumenatum）的STK同源基因DcOAG2在合蕊柱、子房和花粉团中检测到有表达，主要调控石斛兰子房的发育（Xu et al.， 2010）。蝴蝶兰（Dendrobium thyrsiflorum ）的STK同源基因PhalAG2在唇瓣、蕊柱、子房中均有表达，该基因与C类基因共同调控着蝴蝶兰子房的发育（Song et al.， 2006）。石斛兰的STK同源基因DthyrAG2在唇瓣、蕊柱和子房中均有表达，且在胚珠晚期的发育中发挥着重要作用（Skipper et al.， 2006）。

在本研究中，CygoSTK基因主要在春兰的唇瓣、花粉团、合蕊柱和子房中表达，其中在子房中的表达量显著地高于其他花器官，表明CygoSTK基因对春兰子房的形成起着重要的调控作用。在春兰奇花品种‘天彭牡丹中，CygoSTK基因主要在花萼、合蕊柱和子房中表达，CygoSTK基因在春兰‘天彭牡丹花萼中表达量高可能与其花萼增多与形态变异相关，但具体的调控方式还有待于进一步研究。从CygoSTK基因在两个春兰品种花器官的表达模式来看，其主要在合蕊柱和子房中表达，但在子房中的表达量显著高于其他花器官，在春兰花发育过程中可能主要参与调控子房的发育。

综上所述，CygoSTK基因的表达在功能上具有很强的保守性，主要参与春兰子房的发育，同时对该基因的进一步研究对于春兰花器官形态改造及定向的培育具有重要参考价值。

参考文献：

CHEN JM， SONG JY， HE J， et al.， 2016. Studies on volatile components in the flowers of Cymbidium goeringii and Cymbidium faberi in Qinling Mountains [J]. Acta Hortic Sin， 43（12）： 2461-2472. [陈君梅， 宋军阳， 何洁， 等， 2016. 秦岭地区春兰和蕙兰的花挥发性成分研究 [J]. 园艺学报， 43（12）：2461-2472.]

DIRKS-MULDER A， BUTOT R， VAN SP， et al.， 2017. Exploring the evolutionary origin of floral organs of Erycina pusilla， an emerging orchid model system [J]. BMC Evol Biol， 23（3）： 17-89.

HAN YP， KANG KW， KIM DH， et al.， 2018. In vitro propagation of Cymbidium goeringii Reichenbach fil. through direct adventitious shoot regeneration [J]. Physiol Mol Biol Plant， 24（2）： 307-313.

HUMDERTMARK M， HINCHA DK， 2008. LEA （Late Embryogenesis Abundant） proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana [J]. BMC Genomics， 118（9）： 1471-2164.

KRAMER EM， PLUSCA C， PLUS CL， 2019. The developmental evolution of flowers [J]. Curr Top Dev Biol， 131（12）： 211-238.

LIU ZX， YU XN， 2012. Cloning and expressing analysis of a floral homeotic gene PrseAP3 from Prunus lannesiana [J]. J Huazhong Agric Univ， 31（5）： 578-583. [劉志雄， 于先泥， 2012. 日本晚樱同源异型基因PrseAP3的克隆及其在单瓣与重瓣花中的表达分析 [J]. 华中农业大学学报， 31（5）：578-583.]

LIU ZX， LI FL， 2015. Expression of a floral homeotic gene PrseSTK from Prunus lannesiana in single and double flower [J]. Bull Bot Res， 35（4）： 535-539. [刘志雄， 李凤兰， 2015. 樱胚珠发育调控基因PrseSTK在单瓣与重瓣花中的表达比较 [J]. 植物研究， 35（4）：535-539.]

SALEMME M， SICA M， GAUDIO L， et al.， 2013. The OitaAG and OitaSTK genes of the orchid Orchis italica： A comparative analysis with other C- and D-class MADS-box genes [J]. Mol Biol Rep， 40（5）： 3523-3535.

SINGH R， LOW ET， OOI LC， et al.， 2013. The oil palm SHELL gene controls oil yield and encodes a homologue of SEEDSTICK [J]. Nature， 500（7462）： 340-344.

SKIPPER M， JOHANSEN LB， PEDERSEN KB， et al.， 2006. Cloning and transcription analysis of an AGAMOUS and SEEDSTICK ortholog in the orchid Dendrobium thyrsiflorum （Reichb. f.） [J]. Gene， 366（2）： 266-274.

SONG IJ， NAKAMURA T， FUKUDA T， et al.， 2006. Spatiotemporal expression of duplicate AGAMOUS orthologues during floral development in Phalaenopsis [J]. Dev Gene Evol， 216（6）： 301-313.

WU JH， WU SH， YANG C， et al.， 2015. cDNA cloning， sequence analysis and tissue expression of NtSTK gene in Narcissus tazetta var. chinese [J]. Chin J Trop Crop， 36（10）： 1820-1824. [吴菁华， 吴少华， 杨超， 等， 2015. 中国水仙NtSTK基因的克隆、序列和组织表达分析 [J]. 热带作物学报， 36（10）：1820-1824.]

XIANG L， CHEN Y， CHEN L， et al.， 2018. B and E MADS-box genes determine the perianth formation in Cymbidium goeringii （Rchb. f.） [J]. Physiol Plant， 162（3）： 353-369.

XU Y， TEO LL， ZHOU J， et al.， 2010. Floral organ identity genes in the orchid Dendrobium crumenatum [J]. Plant J， 46（1）： 54-68.

YOU YC， PEI FL， YU YH， et al.， 2012. C- and D-class MADS-Box genes from Phalaenopsis equestris （Orchidaceae） display functions in gynostemium and ovule development [J]. Plant Cell Physiol， 53（6）： 1053-1067.

ZUO LJ， YU L， CHEN B， 2017. Studies on rhizome multiplication and differentiation of Cymbidium sinense × Cymbidium goeringii [J]. Agric Biotechnol， 6（6）： 22-25.

（责任编辑 蒋巧媛）