恒清方对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

彭学丰李学敏曹健美李文涛

缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是由于脑血管狭窄或闭塞，导致脑血流阻断使脑组织发生缺血、缺氧，严重时出现坏死软化，引起脑功能障碍的一类疾病，具有高发病率、致死致残率、复发风险等特点，已严重威胁健康。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是脑缺血一定时间恢复血液供应后，脑功能未恢复，引起严重功能障碍，即缺血再灌注损伤，甚至脑水肿和脑出血。缺氧情况下星形胶质细胞释放炎症介质，CIRI后脑组织内渗入血液系统成分，引发血源性水肿，从而使得体内超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及血清白介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)等表达上调[1]。中药恒清方是本课题组长期用于治疗缺血性脑血管病的临床验方，疗效显著[2-5]。本研究探讨恒清方对脑缺血再灌注损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和试剂 Molecular Devices Spectra MAX Plus 384酶标仪(美国BD公司)；Millipore Simplicity纯水仪(美国Millipore公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；TD24A-WS低速台式离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)。BCA蛋白定量测定、SOD(批号：20180405)、MDA(批号：20180406)、NO(批号：20180408)、IL-6(批号：20180302)、TNF(批号：20180414)、IL-1β(批号：20180315)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验材料 恒清方组方：天麻30 g，钩藤30 g，川芎15 g，丹参20 g，葛根20 g，地龙10 g。将上述中药饮片浸泡30 min(蒸馏水)，用文火煎煮15 min，煎煮3次后，将煎煮药液混合并过滤，过滤后分别浓缩为100%(低剂量)、200%(中剂量)、400%(高剂量)恒清方(生药含量分别为1g/mL、2 g/mL、4 g/mL)，置于4 ℃冰箱中。所有中药由上海市第六人民医院中药房提供。

1.3 实验动物 雄性SD大鼠，清洁级，许可证号SCXK(沪)2012-0016，体质量(250±20)g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，饲养于上海懿贝瑞生物医药科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及给药 将48只SD大鼠随机分为6组：模型组(脑缺血再灌注组)、假手术组、恒清方低剂量组、恒清方中剂量组、恒清方高剂量组(恒清方分别为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)和尼莫地平组(尼莫地平20 mg/kg)，各8只。造模前1周开始给药，假手术组与模型组均给予等体积生理盐水。

1.4.2 建立大鼠大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型[6-7]末次给药30 min后，以Longa-Zea改良线栓法建立大鼠MCAO模型。具体方法：称重→10%水合氯醛(0.35 mL/kg)麻醉→固定→颈部正中切口→分离右侧颈外动脉、颈内动脉和颈总动脉→颈总动脉和颈外动脉近心端处结扎→颈内动脉夹闭→颈外动脉和颈内动脉分叉处做一个“V”形切口→石蜡栓线从切口处插入→颈内动脉动脉夹开启→从分叉处将栓线推入颈内动脉→计算栓塞时间→结扎颈总动脉上端→缝合→栓塞1.5 h后拉回线头→栓线头端退至颈外动脉的切口处再灌注→24 h后测定相关指标。

1.4.3 观察指标及方法

1.4.3.1 神经功能评分 再灌注24 h后，观察大鼠神经功能症状，以Bederson方法[8]对各组大鼠进行行为学评分，详见表1。

表1 大鼠行为学评分 单位：分

1.4.3.2 脑含水量、脑指数[9]大鼠脑缺血再灌注24 h后断头取脑组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称脑组织湿重(m1)并记录，再放入恒温干燥箱烘干至恒重，称其干重(m2)并记录。脑含水量、脑指数计算公式：脑组织含水量=(m1-m2)/m1×100%；脑指数=m1/M×100%(M为大鼠体质量)。

1.4.3.3 脑梗死面积[10]取脑组织(再灌注24 h后)→生理盐水洗净残血→滤纸吸干→去除小脑、低位脑干→-20 ℃冰箱冷冻20min(均匀冠状切片，共6片)→脑片浸入1%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液→37 ℃暗处中孵育20 min(梗死面积呈白色，无梗死显示红色)→4%多聚甲醛溶液固定→6 h后取出脑片→滤纸吸去表面液体→相机拍照→Med Brain 2.0测定脑梗死面积。

1.4.3.4 NO、SOD、MDA水平 取脑组织(再灌注24h后)→生理盐水冲洗干净→滤纸吸干→称重→加入1∶9体积生理盐水→10%脑匀浆液→检测总蛋白(BCA法)、NO(硝酸还原酶法)、SOD(酶联免疫法)、MDA(TBA法)。以上检测均按相关试剂盒说明书进行。

1.4.3.5 IL-6、IL-1β、TNF水平 再灌注24 h后→腹主动脉处采血→离心15 min(4 ℃，3 500 r/min)→上清液保存于-20 ℃冰箱→450 nm下酶标仪测定各孔光密度→绘制标准曲线。以上操作按照IL-6、IL-1β、TNF试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 与假手术组比较，模型组神经功能评分升高(P<0.01)；与模型组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组神经功能评分均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方低剂量组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组神经功能评分均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方中剂量组比较，恒清方高剂量组神经功能评分降低(P<0.05)；恒清方高剂量组与尼莫地平组神经功能评分比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较 (±s) 单位：分

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05，③P<0.01；与恒清方低剂量组比较，④P<0.05，⑤P<0.01；与恒清方中剂量组比较，⑥P<0.05；与尼莫地平组比较，⑦P<0.05。

2.2 各组大鼠脑含水量和脑指数比较 与假手术组比较，模型组脑指数、脑含水量均升高(P<0.01)；与模型组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组脑指数、脑含水量均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方低剂量组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组脑指数、脑含水量均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方中剂量组比较，恒清方高剂量组脑指数、脑含水量降低(P<0.05)；与尼莫地平组比较，恒清方高剂量组大鼠脑指数、脑含水量均降低(P<0.05)。详见表2。

组别只数脑指数 脑含水量(%)假手术组80.58±0.03 82.05±0.41 模型组80.72±0.03① 85.15±0.67① 恒清方低剂量组80.70±0.04 84.59±0.87 恒清方中剂量组80.65±0.02②④ 83.60±0.45②④ 恒清方高剂量组80.61±0.01③⑤⑥⑦82.19±0.40③⑤⑥⑦尼莫地平组80.65±0.03②④ 83.68±0.54②④

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05，③P<0.01；与恒清方低剂量组比较，④P<0.05，⑤P<0.01；与恒清方中剂量组比较，⑥P<0.05；与尼莫地平组比较，⑦P<0.05。

2.3 各组大鼠脑梗死面积比较 与假手术组比较，模型组脑梗死面积增加(P<0.01)；与模型组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组脑梗死面积降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方低剂量组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组脑梗死面积均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方中剂量组比较，恒清方高剂量组脑梗死面积降低(P<0.05)；恒清方高剂量组与尼莫地平组脑梗死面积比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图1。

表3 各组大鼠脑梗死面积比较(±s) 单位：%

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05，③P<0.01；与恒清方低剂量组比较，④P<0.05，⑤P<0.01；与恒清方中剂量组比较，⑥P<0.05；与尼莫地平组比较，⑦P<0.05。

图1 各组大鼠脑梗死面积图像(TTC染色)

2.4 各组大鼠NO、SOD和MDA水平比较 与假手术组比较，模型组SOD活性下降(P<0.01)，MDA和NO水平升高(P<0.01)；与模型组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组SOD活性升高(P<0.05或P<0.05或P<0.01)，MDA和NO水平降低(P<0.01)；与恒清方低剂量组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组SOD活性升高，MDA和NO水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与恒清方中剂量组比较，恒清方高剂量组SOD活性升高(P<0.05)，MDA和NO水平均降低(P<0.05)；与尼莫地平组比较，恒清方高剂量组SOD活性升高(P<0.05)，MDA和NO水平降低(P<0.05)。详见表4。

组别只数 SOD(U/mg)MDA(μmol/mg)NO(μmol/mg)假手术组8 35.03±2.67 4.83±0.572.10±0.35模型组8 12.35±2.14①14.72±2.21①5.74±0.59①恒清方低剂量组8 15.33±1.3812.26±2.145.68±0.32恒清方中剂量组8 25.57±3.05②④ 9.36±1.20②④4.81±0.22②④恒清方高剂量组8 31.12±5.26③⑤⑥⑦ 6.11±0.65③⑤⑥⑦2.88±0.35③⑤⑥⑦尼莫地平组8 26.04±4.76②④ 8.98±0.74②④3.49±0.27②④

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05，③P<0.01；与恒清方低剂量组比较，④P<0.05，⑤P<0.01；与恒清方中剂量组比较，⑥P<0.05；与尼莫地平组比较，⑦P<0.05。

2.5 各组大鼠IL-6、IL-1β、TNF水平比较 与假手术组比较，模型组IL-6、TNF、IL-1β水平均升高(P<0.01)。与模型组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组IL-6、TNF、IL-1β水平均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方低剂量组比较，恒清方中剂量组、高剂量组和尼莫地平组IL-6、IL-1β、TNF水平均降低(P<0.05或P<0.01)；与恒清方中剂量组比较，恒清方高剂量组IL-6、IL-1β、TNF水平均降低(P<0.05)；恒清方高剂量组与尼莫地平组IL-6、IL-1β、TNF水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠IL-6、IL-1β、TNF水平比较 (±s) 单位：pg/mL

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05，③P<0.01；与恒清方低剂量组比较，④P<0.05，⑤P<0.01；与恒清方中剂量组比较，⑥P<0.05；与尼莫地平组比较，⑦P<0.05。

3 讨 论

脑缺血损伤为级联反应过程，在缺血性神经元损伤中自由基激发发挥重要作用[11]。一定程度上，SOD活性表明机体抗氧化能力，MDA表明细胞受损伤程度，而NO参与缺血性损伤的病理机制[12]。炎症反应在CIRI机制中发挥重要作用[13]。IL-1β既可促进T细胞与B细胞活化，也可诱导其他炎性介质的产生、白细胞浸润的增多、黏附分子的表达等。IL-6是脑缺血急性期重要的炎症介质。TNF在脑缺血再灌注后诱导的白细胞浸润和组织损伤中发挥重要作用。长期临床研究发现，中药复方恒清方治疗缺血性脑血管病疗效满意[2-5]，并已申请国家专利(申请号：201810677065.8)，但其作用机制尚不明确。

本研究结果显示，与模型组比较，恒清方(中、高剂量)可降低IL-6、IL-1β、TNF水平，减轻缺血再灌注后炎症反应，改善脑组织微环境(P<0.05或P<0.01)；恒清方(中、高剂量)可降低大鼠神经功能评分、脑指数、脑含水量，减小脑梗死面积(P<0.05或P<0.01)，提高脑组织SOD活性(P<0.05或P<0.01)，降低MDA、NO水平(P<0.05或P<0.01)，同时降低血清IL-6、TNF、IL-1β水平(P<0.05或P<0.01)。恒清方上述作用均存在量效关系，即随着恒清方剂量增加，其作用越来越强，即恒清方高剂量>恒清方中剂量>恒清方低剂量，且恒清方高剂量作用优于尼莫地平(P<0.05)。

综上所述，中药恒清方可改善SD大鼠脑缺血再灌注损伤，且其量效关系呈正相关，具体机制可能与抑制炎症反应和抗氧化作用有关。