蒙药斯日西防治实验性胃溃疡作用及机制研究

敖登其木格 王海荣 乌汉其木格 特格喜白音

[摘要] 目的 研究蒙藥斯日西对胃溃疡的防治作用及其可能的机制。 方法 选取25只Wistar大鼠，采用吲哚美辛诱导的急性胃溃疡模型，苏木精-伊红染色观察胃黏膜变化;选取25只昆明小鼠，采用乙醇/HCL诱导的急性胃溃疡模型，观察胃组织中髓过氧化物酶（MPO）活性，总谷胱甘肽（GSH）水平以及外周血T淋巴细胞水平的变化;选取20只Wistar大鼠，采用乙酸烧灼性慢性胃溃疡模型，酶联免疫吸附测定法检测胃组织中炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）表达水平。 结果 与模型组比较，斯日西散组胃黏膜病变减轻;与模型组比较，斯日西散组胃组织MPO活性、大鼠胃黏膜TNF-α、ICAM-1表达水平降低，GSH表达水平升高，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）;与模型组比较，斯日西散组胸腺、脾脏重量指数、外周血CD4+细胞表达水平升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而两组CD3+、CD4+/CD8+、CD8+细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 斯日西散防治胃溃疡的作用机制可能是通过促进防御因子，抑制损害因素，提高免疫能力而实现的。

[关键词] 斯日西;髓过氧化物酶;总谷胱甘肽;T淋巴细胞;肿瘤坏死因子-α;细胞间黏附分子1

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（c）-0023-05

Study on the effect and mechanism of Mongolian medicine Sirixi in preventing and treating experimental gastric ulcer

Aodengqimuge   WANG Hairong   Wuhanqimuge   Tegexibaiyin

Innovative Mongolian Pharmaceutical Preparation Engineering Laboratory， Inner Mongolia International Mongolian Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot   010065， China

[Abstract] Objective To study the preventive and therapeutic effect of Mongolian medicine Sirixi on gastric ulcer and its possible mechanism. Methods A total of 25 Wistar rats were selected to make rat acute gastric ulcer model induced by indomethacin. Changes of gastric mucosa were observed by hematoxylin-eosin staining. A total of 25 Kunming mice were selected to observe the changes of myeloperoxidase （MPO） activity， glutathione （GSH） level and peripheral blood T lymphocyte level in gastric tissues in the ethanol/HCL-induced acute gastric ulcer model. A total of 20 Wistar rats were selected and the expression levels of inflammatory tumor necrosis factor-α （TNF-α） and intercellular adhesion molecule 1 （ICAM-1） in gastric tissues were determined by enzyme-linked immunosorbent assay in a acetic acid-burning chronic gastric ulcer model. Results Compared with the model group， the gastric mucosal lesions were alleviated in the Sirixi Powder group. Compared with the model group， the gastric tissue MPO activity， the expression levels of TNF-α and ICAM-1 in the gastric mucosa of the Sirixi Powder group were decreased， and the expression levels of GSH were increased， the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the model group， the thymus， spleen weight index and the expression levels of peripheral blood CD4+ cells were increased in the Sirixi Powder group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）， while there was no significant difference in the expression levels of CD3+， CD4+/CD8+ and CD8+ between the two groups （P > 0.05）. Conclusion The mechanism of action of Sirixi Powder in the prevention and treatment of gastric ulcer may be realized by promoting defense factor， inhibiting damage factor and improving immune ability.

[Key words] Sirixi; Myeloperoxidase; Glutathione; T lymphocytes; Tumor necrosis factor-α; Intercellular adhesion molecule 1

消化性溃疡是消化系统最常见的慢性疾病，在蒙医医学中属于“胃宝日病”范畴[1-2]。蒙药斯日西是传统蒙医药中的一个经典药物，其功能主治为祛“宝日”病，“宝日”病初，中期嗳气吞酸、胸背作痛、气滞血瘀、血热陷中、潜伏于脏等病症[3-4]。本研究通过观察斯日西散对溃疡模型中胃黏膜、髓过氧化物酶（MPO）活性、总谷胱甘肽（GSH）水平、外周血T淋巴细胞亚群，以及炎性因子的影响，从分子药理学、免疫学等角度探讨蒙药斯日西治疗本病的可能机制，从整体、多方面、多层次为蒙药抗消化性溃疡提供新的治疗思路。

1 对象与方法

1.1 实验动物

25只清洁级雄性昆明小鼠，体重18～22 g，合格证号SCXK（京）2016-0002，由斯贝福生物技术有限公司提供;45只清洁级雄性Wistar大鼠，体重180～220 g，合格证号SCXK（军）2012-0004，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。动物恒温恒湿分笼饲养，普通饲料，自由饮水。

1.2 主要仪器与试剂

BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）;TECAN Infinite M200 PRO多功能酶标仪（瑞士TECAN公司）;Legend micro 17R高速冷冻离心机（Thermo fisher公司）;Sartorius BT25S型電子天平（d=0.01 mg，Max 21 g）;Sartorius BSA423S型电子天平（d=1 mg，Max 420 g）。

斯日西散，由内蒙古国际蒙医医院制剂中心提供;吲哚美辛（批号：BCBK0293V），奥美拉唑（批号：BCBN9849V），雷尼替丁（批号：SLBG4991V）均购自sigma公司;细胞间黏附分子1（ICAM-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（批号：2018/03）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA检测试剂盒（批号：2018/06）均购自R&D公司;MPO活性检测试剂盒（批号：GR3181095-9）由Abcam公司提供;GSH检测试剂盒（批号：102017180315）购自碧云天生物技术有限公司;小鼠T淋巴细胞亚群PE-Cy7 CD3e、PE CD4及FITC CD8抗体试剂盒（批号：7228925）、10×红细胞裂解液（批号：7331798）均购自BD公司。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 吲哚美辛致大鼠胃溃疡实验  将25只Wistar大鼠称重后，按体重随机分为5组，即对照组、模型组、奥美拉唑组（0.02 g/kg）、雷尼替丁组（0.2 g/kg）、斯日西散组（1.25 g/kg，按体表面积折算为临床等效剂量的4倍）。大鼠连续灌胃10 d，最后1 d给药后禁食不禁水24 h。除对照组外，其他组大鼠以80 mg/kg吲哚美辛灌胃，诱导急性胃溃疡模型。6 h后解剖取胃，观察模型组胃黏膜损伤程度，确定造模成功后，4%多聚甲醛固定备用。

1.3.2 乙醇/HCL致小鼠胃溃疡实验  将25只昆明小鼠称重后，按体重随机分为5组，即对照组、模型组、奥美拉唑组（0.02 g/kg）、雷尼替丁组（0.2 g/kg）、斯日西散组（0.91 g/kg，按体表面积折算为临床等效剂量的2倍）。灌胃给药同上。除对照组外，其他组小鼠以0.3 mol HCL/60%乙醇溶液灌胃，诱导急性胃溃疡模型。1 h后摘眼球取血，脱臼处死，解剖取胃，观察模型组胃黏膜损伤程度，确定造模成功后，保存胃、脾脏、胸腺及全血备用。

1.3.3 乙酸烧灼性大鼠胃溃疡实验  将20只Wistar大鼠称重后，按体重随机分为4组，即对照组、模型组、雷尼替丁组（0.2 g/kg）、斯日西散组（1.25 g/kg，按体表面积折算为临床等效剂量的4倍）。除对照组外，其他组大鼠采用玻璃管方式在胃浆膜上滴20 μL 10%冰乙酸诱导胃溃疡模型，第2天开始按照分组情况每天给药2次，共灌胃4 d，最后1次给药完毕后处死，解剖取胃，观察模型组胃黏膜损伤程度，确定造模成功后，保存备用。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 观察吲哚美辛致胃溃疡大鼠胃黏膜病理组织学  胃组织石蜡切片后采用苏木精-伊红（HE）染色法，低倍生物显微镜（40×）下观察胃黏膜病理变化。

1.4.2 检测乙醇致胃溃疡小鼠胃组织MPO活性、GSH水平  分别按试剂盒说明书检测胃组织MPO活性及GSH水平。

1.4.3 测定乙醇致胃溃疡小鼠脾脏、胸腺重量指数  小鼠称量体质量后脱臼处死，取出小鼠脾脏、胸腺，滤纸吸干残留血液，分析天平称重。计算脾脏、胸腺重量指数，脾脏重量指数=脾脏重量（mg）/体质量（g），胸腺重量指数=胸腺重量（mg）/体质量（g）。

1.4.4 流式细胞术检测乙醇致胃溃疡小鼠T淋巴细胞水平  取外周血全血细胞100 μL加入20 μL特异性表面抗体，避光孵育30 min，加入2 mL红细胞裂解液，裂解15 min后洗涤细胞，适量磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬至单细胞悬液，流式细胞仪检测。

1.4.5 检测乙酸烧灼型胃溃疡大鼠胃组织中炎性因子TNF-α、ICAM-1水平  按试剂盒说明书检测胃黏膜TNF-α、ICAM-1水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 斯日西散对吲哚美辛诱导的大鼠胃病模型中胃黏膜的影响

对照组胃黏膜结构完整，层次分明。模型组胃黏膜充血伴急慢性炎细胞，嗜酸性粒细胞浸润，局灶黏膜表面上皮脱落，伴渗出物，褐色颗粒样物附着，黏膜変薄，糜烂，上皮及腺体退变，固有膜、黏膜肌、黏膜下急慢性炎细胞聚集，黏膜下水肿。与对照组比较，奥美拉唑组仅见局灶黏膜变薄，固有膜血管扩张、充血，近黏膜肌处嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润。而雷尼替丁组与模型组比较，仅病变略轻。与模型组比较，斯日西散组局灶黏膜変薄，其他均有，但均减轻。与奥美拉唑组比较，斯日西散组腺体排列稍欠规整，间质及黏膜层可见明显炎症细胞浸润，有轻微的破损、脱落，但与雷尼替丁组比较，斯日西散组病变较轻。见图1。

A：对照组;B：模型组;C：奥美拉唑组;D：雷尼替丁组;E：斯日西散组。HE：苏木精-伊红

图1   各组大鼠胃黏膜病理学观察结果（HE染色，40×）

2.2 斯日西散对小鼠胃组织MPO活性、GSH水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠胃组织MPO活性增强，而GSH表达水平降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。与模型组比较，斯日西散组MPO活性降低，而GSH水平升高，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表1。

表1   斯日西散对急性胃溃疡模型小鼠胃组织MPO活性

和GSH水平的影响（x±s）

注：与对照组比较，##P < 0.01;与模型组比较，**P < 0.01。MPO：髓过氧化物酶;GSH：总谷胱甘肽

2.3 斯日西散对小鼠胸腺、脾脏重量指数的影响

與对照组比较，模型组小鼠胸腺、脾脏重量指数降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。与模型组比较，斯日西散组胸腺、脾脏重量指数升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;奥美拉唑组、雷尼替丁组与模型组胸腺、脾脏重量指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2   斯日西散对急性胃溃疡模型胸腺、

脾脏重量指数的影响（mg/g，x±s）

注：与对照组比较，##P < 0.01;与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

2.4 斯日西散对小鼠外周血T淋巴细胞水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+T淋巴细胞水平降低，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而两组CD3+、CD8+细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，雷尼替丁组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而两组CD8+细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，斯日西散组CD4+细胞表达水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05），而两组CD3+、CD4+/CD8+、CD8+细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。奥美拉唑组与模型组T淋巴细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

表3   斯日西散对急性胃溃疡模型小鼠外周血

T淋巴细胞水平的影响（x±s）

注：与对照组比较，#P < 0.05，##P < 0.01;与模型组比较，*P < 0. 05，**P < 0.01

2.5 斯日西散对胃黏膜中炎性因子TNF-α、ICAM-1表达水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠胃黏膜TNF-α、ICAM-1表达水平均明显上升，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）;与模型组比较，斯日西散组、雷尼替丁组大鼠胃黏膜TNF-α、ICAM-1表达水平降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表4。

3 讨论

消化性溃疡主要由胃、十二指肠黏膜的保护因素和损害因素的关系失调，而引起上消化道内膜的损害所致[5-6]。由于消化性溃疡致病因素的多样性，研制筛选针对各种病因的药物对于胃黏膜病变的治疗具有重要意义，因此开发传统民族药物治疗消化性溃疡已成为一个发展方向[7-11]。蒙医使用斯日西散治疗消化系统疾病经过了悠久的实践证明，取得了良好的疗效。斯日西散是现代蒙医药最常用的方剂，开发具有省时、省力、省开支、疗效确切等优点。

本实验中吲哚美辛诱导的大鼠胃病模型组与对照组比较，具有明显的胃黏膜病理学变化，提示造模成功;而斯日西散组可抵抗胃黏膜的损伤，初步证实斯日西具有防治胃黏膜损伤的作用[12]。

其次本实验中利用乙醇/HCl诱导的小鼠急性胃溃疡模型，探讨了斯日西对胃溃疡的作用机制研究[13]。胃肠道炎症中通常使用MPO活性来评估中性粒细胞的浸润;而黏膜中抗氧化分子的减少，氧化应激反应的增强与GSH水平的降低密切相关[14]。结果显示模型组MPO活性增强、GSH表达水平降低，证实乙醇/HCL诱导的小鼠胃溃疡模型造模成功;而斯日西散组则可降低MPO活性、升高GSH水平，初步推断斯日西防治胃溃疡的机制可能是通过降低损伤因素，升高保护因子而产生的。

消化性溃疡发病的一个重要因素是患者本身免疫功能的改变，有研究指出中药七方胃痛颗粒、康胃愈溃汤Ⅱ号等防治消化性溃疡的作用机制与其调节免疫功能有关[15-18]。也有报道指出长期高剂量服用治疗胃溃疡的常规药物奥美拉唑对小鼠的免疫存在一定的损伤[19]。故本文中观察了斯日西散对小鼠乙醇/HCL急性胃溃疡模型中胸腺、脾脏重量指数及T淋巴细胞亚群的影响，结果显示模型组小鼠胸腺、脾脏重量指数，外周血CD4+、CD4+/CD8+T淋巴细胞水平降低，提示模型小鼠免疫功能受到了一定的损伤。而斯日西散可提高胸腺、脾脏重量指数及CD4+T淋巴细胞水平，初步证实了斯日西散防治胃溃疡作用可能与改善免疫功能有关。同时结果发现奥美拉唑组与模型组比较，胸腺、脾脏重量指数及T淋巴细胞水平表达，差异无统计学意义（P > 0.05），这与文中提到的奥美拉唑对小鼠免疫存在一定的损伤相吻合。

溃疡面的愈合是慢性消化性溃疡预后的一个重要因素，因此本实验中使用乙酸烧灼性大鼠慢性胃溃疡模型探讨了斯日西散对胃黏膜愈合过程中具有重要作用的炎性因子ICAM-1和TNF-α的影响，初步评估了创面愈合的情况[20-22]。实验结果显示，斯日西散组可降低模型组大鼠胃黏膜TNF-α和ICAM-1的表达，提示斯日西散可能通过降低炎性因子，减轻炎性反应，从而改善创面愈合的作用。

综上所述，斯日西散抗溃疡作用明显，并且不是单一的从某一方面发挥抗溃疡作用，而是从多方面多层次发挥作用，故开发斯日西散为抗溃疡制剂，有可能改善西药“治标不治本”的不足，从而降低溃疡病复发率，减少不良反应。

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（收稿日期：2019-09-30  本文编辑：顾家毓）