香烟烟雾暴露对大鼠睾丸组织wnt/β-catenin信号通路的影响

姚艳玲，张静，李林林，黄小溪，买提娜什·那吾塔依，黄云飞，张晨*

(1.新疆医科大学第五附属医院，乌鲁木齐 830001；2.新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐 830001)

香烟燃烧后，其烟雾中含有尼古丁、苯并 A-芘、可尼丁、镉、一氧化碳等大量有害物质，这些有害物质严重损伤男性生殖功能，甚至损伤睾丸组织结构[1]。研究发现，吸烟引起的雄性大鼠生殖系统功能与结构的损伤，与睾丸组织中细胞凋亡及组蛋白乙酰化修饰有关[2]。多项研究表明，尼古丁可以调节神经干细胞[3]、人肺泡间质成纤维细胞[4]、舌鳞状细胞[5]、人气道上皮细胞[6]等多种细胞中wnt/β-catenin信号通路。Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，wnt家族是由19个富含半胱氨酸的糖蛋白组成的蛋白家族，它们不仅在胚胎发育和维持机体的自稳态中起关键作用，而且在细胞的增殖、分化、运动以及抗凋亡过程中也起着重要作用[7]。以往研究发现，激活wnt/β-catenin信号通路可促进成人睾丸支持细胞的增殖，去睾丸骨质疏松小鼠wnt/β-catenin信号通路受到抑制，提示睾丸组织生长发育过程与wnt/β-catenin信号通路息息相关[8]。本文利用不同剂量的香烟烟雾暴露不同时间损伤的大鼠模型，观察香烟烟雾对睾丸组织结构损伤及其对wnt/β-catenin信号通路分子表达的影响，以期进一步解释香烟烟雾对睾丸组织损伤的分子机制。

材料与方法

一、实验动物及试剂

1.实验动物：由新疆医科大学实验动物中心提供清洁级8周龄雄性SD大鼠200只，体重为180～220 g，实验动物许可证：SYXK(新)2017-0001。动物实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批(批准号：IACUC-20170706-05)。

2.主要试剂：某品牌的过滤嘴香烟(烟气烟碱量1.2 mg，焦油量10 mg，新疆卷烟厂)。大鼠来源的Wnt-2b、β-catenin、GSK-3β及GAPDH引物序列见表1。兔抗大鼠多克隆一抗：wnt-2b抗体(ab178418)购自英国Abcam公司；β-catenin抗体(AF6266209794)、磷酸化-β-catenin抗体(Ser33/37/Thr41，DF2989209794)及GSK-3β抗体(AF501628373)均购自美国Affnity公司；GAPDH抗体(10494-1-AP)购自美国Proteintech公司。HRP标记的二抗购自北京中杉金桥试剂公司。

表1 RT-PCR睾丸组织中相关基因引物序列表

二、研究方法

1.实验动物分组：适应性喂养一周后，按照香烟暴露剂量分为4大组：正常对照组(0根香烟/d，即新鲜空气)，低剂量组(10根香烟/d)，中剂量组(20根香烟/d)和高剂量组(30根香烟/d)。每组按照香烟暴露时间又分为2周、4周、6周、8周和12周共5个亚组。每个亚组10只动物。给予普通饲料，自由进食，饲养室温度控制在(24±2)℃，湿度控制在40%～60%。

2.动物模型建立：参照课题组之前的造模方法[10]，采用呼吸道静式染毒法。染毒组大鼠置于自制染毒箱内(80 cm×60 cm×80 cm)，每个染毒箱中每次放置2～3笼大鼠(共计10～15只)。低剂量组一次性点燃10支香烟，烟雾进入染毒箱内，10 min左右香烟燃尽后，大鼠暴露于香烟烟雾中0.5 h，打开染毒箱通风30 min，拿出染毒组大鼠。同样的方法每次点燃20支香烟和30支香烟进行中、高剂量组大鼠的染毒。每日一次，每次0.5 h。相应暴露时间结束后立即处死大鼠。对照组大鼠每日被放置于与染毒组染毒箱完全相同的装置内，但未进行被动吸烟的操作。

3.标本采集：相应染毒时间结束，腹腔注射2%戊巴比妥钠(3 ml/kg)麻醉，分离双侧睾丸组织，以 4℃生理盐水漂洗，用滤纸吸干水分，一侧睾丸组织固定于4%的多聚甲醛中，进行HE染色，观察睾丸组织的病理改变。另一侧睾丸组织液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

4.分子检测：采用RT-PCR及Western blot方法测定睾丸组织中wnt-2b、catenin及GSK-3β基因在mRNA及蛋白水平上的表达。

5.基因和蛋白定量计算：选取大鼠睾丸组织中GAPDH为内参基因，mRNA表达水平计算方法主要采用相对表达量=2-ΔΔCt法，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt暴露组-ΔCt对照组。蛋白相对量的表达利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行条带灰度值分析，检测目标蛋白与GAPDH的灰度比值。

三、统计学处理

结 果

一、香烟烟雾对大鼠一般情况的影响

随着暴露时间和暴露剂量的增加，和正常对照组相比，低剂量暴露组的体重增长没有受到明显的抑制，吸烟6周后出现皮毛发黄，12周后出现自主活动减少；中剂量暴露组的体重增长在吸烟4周后出现明显抑制，吸烟8周后出现相互撕咬等烦躁的情况；高剂量暴露组的体重增长全程均受到明显抑制，并在吸烟6周后出现精神欠佳、自主活动减少，8周后出现步态不稳现象。

二、香烟烟雾对雄性大鼠睾丸组织结构的影响

HE染色结果显示，正常对照组的睾丸组织中曲细精管基膜完整，曲细精管中各级精母细胞发育正常、排列整齐、层次清楚，管腔中央可见大量成熟精子，且支持细胞及间质细胞结构正常(图1A、E、I、M、Q)。

图1 各组大鼠睾丸组织HE染色(×100)；标尺=100 μm

低剂量暴露组从第4周开始(图1F)曲细精管间隙增宽，第6周(图1J)曲细精管基底膜发生破裂，第8周(图1N)出现缺乏各级精母细胞的空曲细精管，间质中血管出现充血、水肿，第12周(图1R)空曲细精管间隙增宽更加明显，间质中血管出现充血、水肿。中剂量暴露组从第4周(图1G)开始曲细精管基底膜发生破裂，各级生精细胞排列紊乱，第6周(图1K)出现缺乏各级精母细胞的曲细精管，官腔中央成熟精子数目减少或未见成熟精子，第8周(图1O)出现大范围空管样曲细精管，第12周(图1S)出现更大范围空管样曲细精管。高剂量暴露组从第2周(图1D)开始曲细精管间隙变宽，第4周(图1H)曲细精管间隙变得更宽，各级生精细胞排列紊乱，第6周(图1L)出现大面积的无各级精母细胞的曲细精管，间质血管周围出现中性粒细胞浸润，第8周(图1P)出现更大面积的无各级精母细胞的空曲细精管，间质血管周围出现中性粒细胞浸润，第12周(图1T)曲细精管萎缩明显，官腔中央未见成熟精子，间质增宽异常明显，间质血管周围出现中性粒细胞浸润。

三、香烟烟雾对雄性大鼠睾丸组织中 wnt-2b、β-catenin及GSK-3β基因mRNA表达水平的影响

RT-PCR结果显示，与正常对照组相比，随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加，wnt-2b mRNA表达水平在8周中剂量暴露组及12周中、高剂量暴露组均出现下调(P<0.05)(图2A)；β-catenin mRNA表达水平在各剂量暴露组均出现显著下调(P<0.01)(图2B)；GSK-3β mRNA表达水平在8周及12周中、高剂量暴露组中均显著上调(P<0.05)(图2C)。

A：wnt-2b；B：β-catenin；C：GSK-3β；与正常对照组比较，*P<0.05，#P<0.01图2 不同时间和剂量的烟雾暴露对大鼠睾丸组织中wnt-2b、β-catenin及GSK-3β基因mRNA表达水平的影响

四、香烟烟雾对雄性大鼠睾丸组织中wnt-2b、β-catenin、P-β-catenin以及GSK-3β蛋白表达水平的影响

Western blot结果显示，和正常对照组相比，香烟暴露组大鼠睾丸组织中wnt-2b、β-catenin蛋白表达水平随着暴露时间和暴露剂量的增加而减少，以8周和12周暴露组减少最为显著(P<0.05)，P-β-catenin和GSK-3β蛋白表达水平随着暴露时间和暴露剂量的增加而升高(P<0.05)(图3)。

A：wnt-2b；B：β-catenin；C：P-β-catenin；D：GSK-3β；与正常对照组比较，*P<0.05，#P<0.01图3 不同时间和剂量的烟雾暴露对大鼠睾丸组织中蛋白表达水平的影响

讨 论

wnt通路有三条：经典的wnt途径、wnt/PCP(planner cell polarity pathway)通路和非经典的wnt/Ca2+途径[11]。经典和非经典途径之间的区别就是是否依赖于β-catenin蛋白，经典途径依靠其发挥作用，而非经典途径不依赖于β-catenin，通过释放胞内Ca2+来影响细胞粘连和相关基因表达。一般提到wnt信号通路主要指的是由β-catenin介导的经典wnt信号通路。wnt信号通路的激活需要其与细胞表面的配体Frizzled(Fz)家族受体结合，磷酸化细胞内Dishevelled(Dsh)蛋白。Dsh是wnt信号通路三条途径中共同的调节蛋白。通常，在没有wnt蛋白的情况下，β-catenin不能在细胞质中积累，因为它会被降解复合物(APC，Axin和GSK3)降解，随后将通过蛋白酶体消化。在经典wnt途径中，降解复合物(APC，Axin和GSK3)会受到破坏，wnt蛋白与细胞膜表面的受体Frizzled(Fz)相结合，引起β-catenin蛋白在胞浆中聚集，随后，β-catenin移位至细胞核[12]。在细胞核中，β-catenin蛋白结合TCF/LEF启动子，进一步调控靶基因的表达，包括AXIN2和C-myc等。因此，Wnt信号的激活就是指分泌型的配体蛋白Wnt与膜表面受体蛋白FZD结合后，激活胞内蛋白DVL。DVL通过抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解复合物的降解活性，稳定细胞质中游离状态的β-catenin蛋白。胞浆中稳定积累的β-catenin进入细胞核后结合LEF/TCF转录因子家族，启动下游靶基因(如c-myc、Cyclin D1等)的转录。Wnt信号通路在机体增殖、分化、炎症和凋亡等多个生物学过程中都起重要作用[13-14]。研究表明，人或小鼠的肺肿瘤组织均有非磷酸化β-catenin表达，特别是经过香烟烟雾的刺激后，无磷酸化β-catenin的表达显著增加。另外，已经证实，尼古丁可以调节多种细胞中的wnt/β-catenin途径[3-5，8]。

雄性哺乳动物从青春期到死亡，生精细胞历经发生、增殖与成熟最终形成精子，这其中非常重要的组织即为睾丸组织[15]。睾丸表面覆以浆膜及鞘膜脏层，深部为致密结缔组织构成的白膜，白膜在睾丸后缘增厚形成睾丸纵膈。纵膈的结缔组织呈放射状伸入睾丸实质，将睾丸实质分成约250个锥形小叶，每个小叶内有1～4 条弯曲细长的生精小管。生精小管是由生精上皮构成，生精上皮由支持细胞和5～8层生精细胞组成，生精细胞与支持细胞成圆柱形排列在生精小管的基膜上，毗邻支持细胞的是血睾屏障，血睾屏障将生精小管分为两个区，即基底部与管腔，在生精小管基底上有支持细胞、精原细胞与精母细胞。在生精小管的管腔中有初级精母细胞及其他不同分裂期的精细胞。

本实验中，我们发现香烟暴露组大鼠睾丸组织出现明显的损伤，随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加，曲细精管基底膜发生破裂，各级生精细胞排列紊乱甚至消失，出现大范围空管样的曲细精管，间质细胞消失，间质血管周围出现中性粒细胞浸润。香烟暴露组大鼠睾丸组织中的wnt-2b、β-catenin在mRNA和蛋白水平上均出现明显下调，负性调控蛋白GSK-3β在mRNA和蛋白水平上均出现明显上调，磷酸化β-catenin在蛋白水平上出现明显上调。这说明香烟被动吸入抑制了wnt/β-catenin信号通路的激活，除直接抑制wnt-2b基因在mRNA和蛋白水平的表达外，还通过上调负性调控蛋白GSK-3β在mRNA和蛋白水平使睾丸组织中β-catenin发生磷酸化而降解，从而使进入细胞核内促使生殖细胞发生分化、增殖作用的β-catenin减少，进而影响生殖系统的分化、增殖功能。综上所述，我们的实验结果表明香烟烟雾引起雄性大鼠生殖系统的损伤，而且这种改变可能和睾丸组织中下调的wnt/β-catenin信号通路有关。