精液处理前和精子优化处理后孵育时间对夫精宫腔内人工授精临床结局的影响

杨志伟，耿亚松，李国臻，陶林林，郑波

(邢台不孕不育专科医院，邢台生殖与遗传专科医院，邢台 054000)

夫精宫腔内人工授精技术(IUI-AIH)是将丈夫精液在体外经过优选处理去除精浆，通过注入等方法辅助活动良好的精子进入女性宫腔，促使精卵自然结合以获得妊娠生育的辅助生殖技术[1-2]。对于治疗男性因少精子症、弱精子症、液化异常、性功能障碍和生殖器畸形等导致的不育和女性宫颈因素、生殖道畸形及心理因素导致性交不能等引起的不孕，是一种经济、有效、安全而应用广泛的一线治疗手段[1]。然而，其妊娠率受多种因素制约，目前夫精人工授精的妊娠率只有8%～25%[3]，而且有关IUI周期妊娠率的主要影响因素尚存争议。本研究主要探讨精液优化处理前后精子孵育时间对宫腔内人工授精妊娠结局的影响，以期为宫腔内人工授精标准流程提供合理的依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2018年10月至2019年3月在我院生殖医学中心接受AIH-IUI治疗的107对夫妇的临床资料。纳入标准：(1)女方年龄≤35周岁，首次行IUI；(2)男性不育因素为少精子症、弱精子症、液化异常、性功能障碍、生殖器畸形等；女性不孕因素为宫颈因素、生殖道畸形及心理因素导致性交不能。排除标准：(1)卵泡未破裂黄素化综合征者；(2)男女一方患有生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病；(3)一方患有严重的遗传、躯体疾病或精神心理疾患；(4)优化处理后活动精子总数≥10×106个。

二、研究方法

1.促排卵方案：女方月经周期规律者选择自然周期排卵；月经周期不规律或者排卵障碍时采用促排卵周期，促排卵周期月经第3～5天给予来曲唑(伊美舒，浙江海正)口服、肌肉注射尿促性素(乐宝得，珠海丽珠)或者联合用药，持续用药5 d，阴道超声动态监测卵泡发育情况及子宫内膜厚度。观察卵泡直径>16 mm或者子宫内膜厚度>8 mm时，使用尿LH试纸(昆明云大生物技术)进行定性检测。尿LH阳性，则抽血进行血清激素定量检测有无LH峰。当B超显示卵泡直径>18 mm、血LH出峰，给予HCG(珠海丽珠)10 000 U 肌肉注射，次日B超检测有无排卵，若无排卵安排排卵前和排卵后两次授精，若排卵则安排一次授精。如直径≥14 mm的优势卵泡≥3个，放弃该治疗周期或改体外授精胚胎移植周期。

2.精液处理：男方禁欲2～7 d，手淫取精于无菌容器内，室温液化后进行精液常规检查。用G-MOPS PLUS(Vitrolife，瑞典)将SpermGrad(Vitrolife，瑞典)稀释成90%和45%两种浓度的液体，先用巴斯德吸管在离心管中加入1 ml 45%溶液，在其下层试管底部缓慢加入1 ml的90%溶液，然后在顶层缓慢加入所有精液，300g离心15 min。去上层液，底层精子沉淀转移到1.5 ml G-MOPS PLUS 中，300g离心5 min，洗涤两次。收集底层精子转入到0.5 ml G-MOPS PLUS中混匀。镜检后室温孵育，待行人工授精。

3.人工授精：术前排空膀胱，取膀胱截石位，打开无菌人工授精包，用温盐水冲洗外阴，冲洗完毕后，铺无菌治疗巾于患者双腿，将温盐水倒入小量杯，置窥阴器，清洗阴道及宫颈分泌物，清洗完毕。用1 ml BD注射器抽吸精液约0.5 ml，连接人工授精导管，将导管插入宫腔，缓慢将精液注入宫腔距宫颈6～6.5 cm处，注入完毕后，将人工授精管缓慢撤出。术后抬高臀部，卧床30 min。当日常规使用黄体酮(安琪坦，博赏医药，法国)口服或阴道给药进行黄体支持。

4.分组：精液处理前孵育时间分为A1(0～15 min)、A2(15～45 min)和A3(>45 min)三组，两次授精的液化时间不一致，计为两个周期；记录精子优化处理后孵育时间分为B1(0～15 min)、B2(15～45 min)和B3(>45 min)三组，两次授精的孵育时间不一致，计为两个周期。比较不同分组各组间的临床妊娠率差异。

5.观察指标：授精后28～35 d B超检查，见孕囊确定临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠例数/总人工授精例数×100%。参考《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版，精液量、精子浓度、前向运动(PR)精子百分比和正常形态精子百分比等正常者诊断为正常精子[4]，正常精子率=诊断正常精子例数/总人工授精例数×100%。

三、统计学处理

结 果

一、一般资料比较

本研究共纳入107对夫妇(授精次数共173次)，按临床妊娠结局分为妊娠组和非妊娠组。通过比较发现，妊娠组和非妊娠组女方年龄、原发不育占比、正常精子率、授精次数、宫腔注入前向运动精子总数的差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 妊娠组和非妊娠组一般资料比较[(-±s)，n(%)]

二、精液处理前孵育时间对IUI-AIH临床妊娠的影响

精液处理前不同孵育时间组(A1、A2和A3)的临床妊娠率分别为16.67%、29.73%和13.85%，其中A2组的临床妊娠率显著高于A3组(P<0.05)，较A1组略有增高(P>0.05)；各组间女方年龄、原发不育占比、正常精子率、宫腔注入PR精子总数的差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 精液处理前不同孵育时间对临床妊娠结局的影响比较[(-±s)，n(%)]

注：例数按授精次数算。与A1组比较，#P<0.05；与A2组比较，*P<0.05

三、优化后精子孵育时间对IUI-AIH临床妊娠的影响

精子优化后不同孵育时间组(B1、B2和B3)的临床妊娠率分别为18.52%、20.59%和15.91%，B2组的临床妊娠率相对其他两组有增高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；各组间女方年龄、原发不育占比、正常精子率、宫腔注入PR精子总数的差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 精子优化后不同孵育时间对患者临床妊娠结局的影响[(-±s)，n(%)]

注：例数按授精次数算。与B1组比较，*P<0.05；与B2组比较，#P<0.05

四、相关因素与IUI临床妊娠的Logistics回归分析

纳入可能影响临床妊娠的相关因素，多因素Logistic回归分析结果显示，女方年龄、原发不育占比、正常精子率、授精次数、宫腔注入PR精子总数与IUI临床妊娠率无显著相关性(P>0.05)，但随着原发不育占比和正常精子率的增加，IUI临床妊娠率有增高趋势；处理前孵育时间与IUI临床妊娠率呈非线性相关，处理前孵育时间在15～45 min间(A2组)可显著提高临床妊娠率(P<0.05)；优化后精子孵育时间与IUI临床妊娠率的关系具有相似的趋势，孵育时间在15～45 min间(B2组)有提高临床妊娠率的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 影响妊娠因素的Logistic回归分析

讨 论

IUI-AIH是一种经济、有效、安全而应用广泛的一线辅助生殖治疗手段[5]，由于无创的操作和极少的配子胚胎体外培养时间，优先被不孕不育症夫妇选用。然而，针对于精液在体外的孵育时间的规范鲜有报道，本研究主要通过不同孵育时间临床结局的比较和多因素相关分析阐明精液处理前孵育时间和优化后精子孵育时间对IUI-AIH临床结局的影响。

通过对妊娠组和非妊娠组相关资料的比较和相关因素与临床妊娠的相关性分析，本研究纳入资料的女方年龄、原发不育占比、正常精子率、授精次数、宫腔注入前向运动总数均无统计学差异。国玉蕊等[1]的研究显示，同一周期行双次人工授精未提高人均妊娠率，显著提高了周期妊娠率，两次人工授精能避免卵母细胞错过最佳受精时间。我们的患者资料均为首次行人工授精，但未显示两次人工授精的优势，可能由于卵母细胞受精时间窗维持在12～24 h，射精后精子受精能力也可持续到48～72 h。考虑到两次授精的孵育时间不一致，记为两个周期进行统计分析。

精子随精浆排出体外后，精浆的微环境与精子发生的微环境有着比较大的差异[6]，可能与精子的成熟相关。有报道精浆中血清同型半胱氨酸、INH-B和锌-α2糖蛋白等多种因子与精子的活性相关[7-8]。Bjorndahl等[9]发现精子染色质结构的状态在体外可能会有所不同，这取决于精子在射精后储存在精液中的消耗锌条件，因此精浆与精子的共孵育有助益精子成熟。我们发现较少的处理前孵育时间不能获得较好的IUI临床妊娠结局，可能是因为精子活化相关物质过早分离、不利于精子活化。但是，射精后孵育时间的延长不利于精子存活，反而使受精的有害物质逐渐积累。Crha等[10]研究指出精浆中高浓度的Hcy有直接的细胞毒性，造成内膜的损伤，氧化应激物质(ROS)的过度产生，转甲基作用受到抑制，甚至出现基因的异常表达[10-11]，因此过长的精液处理前孵育时间不利于人工授精等辅助生殖技术获得较好的妊娠结局。我们的研究结果证实，精液处理前的孵育时间>45 min组相对于孵育时间在15～45 min组具有较差的临床妊娠结局。

女性生殖道不同位置具有不同的理化性质，精子染色体的解聚过程与这些理化性质的动态变化紧密相关[9]，正确的时间点到达合适的位置有利于卵母细胞正常受精。梁嘉颖等[12]的研究指出，精液优化处理后过早和过晚行人工授精不利于临床妊娠。随着孵育时间的延长精子染色体逐渐解聚，精卵孵育60 min后，精子染色体解聚度可从25%增长为80%，精子染色体解聚度<70%时不能使卵子正常受精[12-13]。精子表面上吸附着具有氧化酶活性的成分，可以稳定精子的各种结构，精子运动的能量主要来源于精子中段进行的糖酵解产生的三磷酸腺苷(ATP)[10]，随着精子孵育时间的增加具有氧化酶活性的成分和ATP会被大量消耗，不利于受精。此外有研究证实，顶体反应的发生具有时间依赖性，体外孵育时间越长，顶体反应率越高[14-15]。精子在培养液中发生过度的自发顶体反应会影响卵母细胞正常受精进而降低临床妊娠率，同时随着精子体外孵育时间的增加精子DNA碎片率也会显著增加，影响精子的受精能力[16]，因此应该避免较长的精子优化处理后的孵育时间。我们的研究显示精子优化处理后时间在15～45 min时没有显著提高宫腔内人工授精的临床妊娠，但精液优化处理后精子孵育时间<15 min和孵育时间>40 min时的AIH-IUI 临床妊娠率有降低的趋势。

综上所述，精液处理前的孵育时间与宫腔内人工授精妊娠结局显著相关，我们建议精液采集后15～45 min内开始优化处理，同时应尽量保证处理后孵育时间在15～45 min内行宫腔内人工授精。本研究样本量较小，有待大样本量持续验证，为获得更加稳定的IUI临床妊娠提供参考。