甜荞米中叶绿素、总酚、PPO与褐变的关系

程 哲 郭 洪 胡俊君 何永吉 李红梅 李云龙

(山西省农业科学院农产品加工研究所；特色农产品加工山西省重点实验室，太原 030031)

荞麦属蓼科(Polygonaceae)荞麦属(FagoprumMill)，营养价值高，素有“五谷之王”的美称，既富含蛋白质、脂肪、淀粉、维生素、微量元素和纤维等营养成分，能满足人类补充能量的基本要求，又因功能成分的含量及活性较高，可作为药食兼用的保健食品原料[1，2]。荞麦常以面条、面包、茶、醋、酒等多种形式被人们食用[3-6]。

荞麦经储藏后内在营养成分和功能成分等品质下降[7-9]，尤其是外观色泽劣化直接导致商品价值降低，制约着荞麦利用和出口创汇[10]。目前，关于荞麦品质变化的研究虽有报道，但主要集中在荞麦原粮和荞麦制品方面[11-14]，而针对近年来因食用方便、适口性好而深受消费者欢迎的脱壳后的甜荞米[15,16]，其储藏及货架期色泽变化的相关研究尤其是机理研究较少。本研究针对脱壳后的甜荞米从浅绿色转变为红褐色的褐变现象，从叶绿素、总酚含量及多酚氧化酶活性等的变化展开探讨，探索其褪绿、酶促和非酶促引起的褐变过程，以期为延长甜荞米储藏时间和货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以2018年9月下旬成熟的品甜2号、通荞2号和赤甜1号为原料，均由国家燕麦荞麦产业技术体系乌兰察布试验站提供。

1.2 主要仪器与设备

756紫外可见分光光度计；HH-2电子恒温水浴锅；TGL20C冷冻离心机；NW-1色差仪。

1.3 试剂

甲醇、乙醇、没食子酸、柠檬酸、邻苯二酚、丙酮、磷酸氢二钠、碳酸钠等均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 原料预处理

将甜荞原粮，除去沙尘、草籽等杂质，自然晾干后，分级脱壳为甜荞米，选择无病虫害、无破碎的整米作为褐变前的样品。将样品单层平铺，在室温阳光下放置储藏，分别于0、20、40、60、80 d取出一定量样品进行跟踪分析。

1.4.2 色度的测定

ΔE*=

1.4.3 叶绿素的测定

参考Arnon D.I.法[18-20]：

叶绿素a浓度：Ca=0.012 72A663-0.002 59A645；

叶绿素b浓度：Cb=0.022 88A645-0.004 67A663；

叶绿素总浓度：C=Ca+Cb。

1.4.4 总酚含量的测定

参照Folin-Ciocalteu 比色法测定总酚含量[21，22]。

标准曲线制作：用70%甲醇配制1 mg/mL 没食子酸溶液，配成浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL没食子酸标准溶液。分别吸取0.5 mL标准溶液置于试管中，加入0.8 mL福林酚试剂和0.7 mL蒸馏水，摇匀后避光放置6 min，再加2.5 mL 7%碳酸钠溶液及2 mL蒸馏水，40 ℃水浴40 min，测定760 nm波长下的吸光值。以吸光值(A760)对没食子酸浓度(c)线性回归后得到回归方程：y=9.725 3x+0.003 45，R2=0.999 3。

样品测定：用粉碎机将待测甜荞米粉碎，全部过60目筛，准确称取0.500 0 g，用50 mL 70% 甲醇于65 ℃水浴中提取3 h，吸取0.5 mL上清液，测定760 nm处吸光度。甜荞米的总酚含量表示为每克干样中含有的多酚量(以没食子酸计)。

1.4.5 多酚氧化酶活性的测定

参考贾爱霞等[23]和李红军等[24]的测定方法。称量2.000 0 g 甜荞米于冰浴中研磨后，转移至50 mL离心管中，准确量取20 mL磷酸氢二钠-柠檬酸(0.1 mol/L，pH 6.0)缓冲溶液，摇匀，放置4 ℃冰箱24 h， 8 000 r/min，冷冻离心5 min，上清液即粗酶液。将加入0.5 mL邻苯二酚(0.2 mol/L)和0.5 mL磷酸盐-柠檬酸缓冲的试管于37 ℃水浴3 min，加入0.4 mL酶液后，再于37 ℃水浴20 min，在420 nm处测定其吸光值。以测定条件下每分钟吸光度值增加0.001定义为一个酶活力单位(U)。

1.4.6 相关性分析

采用SPSS软件进行皮尔逊相关性分析，**表示P<0.01，为极显著相关，*表示P<0.05，为显著相关。

2 结果与分析

2.1 甜荞米储藏期色度变化

根据对荞麦米(品甜2号)储藏期间观察发现，随着储藏时间推移，荞麦米颜色不断加深，图1色度实验结果表明，储藏80 d，荞麦米的ΔE*逐渐增加，其中ΔL*、Δa*和Δb*变化趋势不一，ΔL*逐渐降低，样品色泽由亮逐渐变暗；Δa*逐渐增加，颜色由绿色向红褐色转变；而Δb*则无明显变化趋势。

同时，将ΔL*、Δa*和Δb*均与ΔE*进行相关性分析，发现ΔL*与ΔE*极显著负相关，Δa*与ΔE*极显著正相关，但Δb*与ΔE*相关性不显著(P>0.05)。因此，甜荞米褐变过程中，色度值ΔL*、Δa*和Δb*对褐变的贡献程度不一。

图1 甜荞米储藏过程中色度变化

2.2 甜荞米储藏期叶绿素含量与褐变的关系

甜荞米(品甜2号)中总叶绿素含量为(25.56±0.03) mg/kg，其中叶绿素a含量为(15.03±0.12) mg/kg，叶绿素b为(10.53±0.08) mg/kg。如图2所示，叶绿素含量随储藏时间推移明显降低，第80 d与0 d相比，总叶绿素含量降低了14.06 mg/kg，其中，叶绿素a降低程度大于叶绿素b：叶绿素a降低了9.03 mg/kg，叶绿素b降低了5.03 mg/kg，且叶绿素b在储藏20 d，略减少0.29 mg/kg，变化趋势不明显，自20 d以后减少速度加快。对叶绿素含量随时间变化进行线性回归分析，方程分别为总叶绿素(y=-0.184 2x+26.15，R2=0.985 3)，叶绿素a (y=-0.118 2x+15.24，R2=0.979 5)，叶绿素b(y=-0.066 1x+10.91，R2=0.959 9)。斜率表明叶绿素a减少速率明显高于叶绿素b，说明叶绿素a绿色褪去速率大于叶绿素b。

图2 甜荞米储藏过程中叶绿素含量变化

对储藏期叶绿素含量变化与色度变化进行相关性分析，结果如表1。叶绿素与ΔE*呈现显著负相关性(P<0.05)，且与ΔL*显著正相关(P<0.05)，尤其与Δa*极显著负相关(P<0.01)。其中，叶绿素a与叶绿素b均与色度显著相关，且叶绿素a与ΔE*、ΔL*和Δa*的相关系数均大于叶绿素b。结果表明，叶绿素对甜荞米褐变有影响，且叶绿素a的影响大于叶绿素b。

表1 甜荞米叶绿素含量变化与色度变化的相关性

注：**为极显著相关；*为显著相关，余同。

2.3 甜荞米储藏期总酚含量与褐变的关系

储藏一段时间后的甜荞米，生物代谢速率减缓，合成酚的能力随之下降，且酚类物质经过一系列的氧化作用形成褐色素或类黑色素，总酚含量随着储藏时间推移而降低，最终发生褐变。图3结果表明，甜荞米中(品甜2号)总酚含量在储藏期明显下降，其含量变化与色度变化呈现显著或极显著相关性(表2)。

图3 甜荞米储藏过程中总酚含量变化

因此，选3种总酚含量低[通荞2号，(5.70±0.084) mg/g]、中[赤甜1号，(6.19±0.046) mg/g]、高[品甜2号，(6.86±0.092) mg/g]的甜荞米样品进行储藏观察。如图4所示，3种甜荞米发生褐变，且程度不同，从20～80 d，ΔE*、ΔL*和Δa*均是通荞2号<赤甜1号<品甜2号，Δb*无明显规律。整体来说，总酚含量高的品甜2号在各个时间段的褐变程度最严重。

甜荞米ΔE*、ΔL*、Δa*和Δb*值与储藏时间经多项式回归分析，结果如表3所示。通过比较回归方程的系数发现，3个品种的ΔE*、ΔL*和Δa*值的变化速率均是通荞2号<赤甜1号<品甜2号，表明总酚含量高的甜荞米的褐变速率最大。

表3 甜荞米的色度值与储藏时间的多项式回归方程

图4 3种甜荞米储藏过程中色度变化

甜荞米发生褐变的同时，3个品种的总酚含量均呈降低趋势(图5)，储藏80 d时，通荞2号的总酚含量降低了0.315 mg/g，变化最小，赤甜1号和品甜2号的总酚含量降低程度相近。

将3种甜荞米的总酚含量与色度进行相关性分析，如图6所示，3个品种的总酚含量与ΔE*和Δa*呈负相关，与ΔL*正相关，均与Δb*无显著相关。其中总酚含量低的通荞2号中，总酚与各色度值的相关性均不显著；总酚含量居中的赤甜1号中，总酚与各色度值均显著相关；总酚含量较高的品甜2号中，总酚与ΔE*和Δa*极显著相关，与ΔL*显著相关。

图5 3种甜荞米储藏过程中总酚含量变化

图6 3种甜荞米总酚含量与色度相关性

酚对甜荞米褐变有影响，对于总酚含量低的品种，酚对褐变的影响最低，对于酚含量较高的品种，酚对褐变的影响较高。因此，从褐变的角度考虑，可以优先选择总酚含量较低的品种储藏甜荞米。

同时，虽然通荞2号、赤甜1号和品甜2号储藏前叶绿素含量不一，但它们的叶绿素与ΔE*的相关性均显著，相关系数分别为-0.984**、-0.954*和-0.950*。整体来说，叶绿素与色度的相关系数大于总酚，即叶绿素对褐变的影响大于酚的影响。

2.4 甜荞米多酚氧化酶(PPO)活性与褐变的关系

荞麦收割晒干，尤其甜荞籽粒去皮后，细胞膜被破坏，酚酶区域化结构破坏崩溃，酚类物质与PPO接触，引起褐变[25，26]。PPO活性在储藏初期0～20时呈升高趋势，并在20 d出现高峰，之后迅速下降，在储藏60～80 d后变化速度减缓，PPO活性开始缓慢降低。可能是PPO的底物酚类物质逐渐被氧化减少，而产物醌类物质增多，从而导致酶活性下降[27]。

在甜荞米褐变过程中，3个品种的PPO活性变化趋势一致(图7)，说明PPO参与了褐变过程。品甜2号的PPO活性始终高于通荞2号和赤甜1号，表明褐变越严重的品种，PPO活性越高。表4显示通荞2号的PPO活性与酚含量显著负相关，而与色度不显著相关；赤甜1号的PPO活性与酚含量和色度均无显著相关性；品甜2号的PPO活性与酚含量无显著相关性，与色度显著相关。

PPO对于甜荞米的褐变影响低于酚类物质，且PPO作用于酚的酶促褐变在储藏初期的作用大于储藏后期。虽然储藏后期PPO活性降低，但是甜荞米的褐变仍在进行，从而侧面印证了酚类既通过酶促又通过非酶促的方式参与了甜荞米褐变。

图7 甜荞米储藏过程中PPO活性随时间的变化

表4 PPO活性与色度和总酚含量相关性

3 结论

甜荞米在储藏过程中发生褐变，色度值ΔL*、Δa*和Δb*对褐变的贡献程度不一。叶绿素含量减少对甜荞米褐变有影响，其中叶绿素a含量变化程度和褪绿速率均大于叶绿素b，且叶绿素a与色度相关系数亦大于叶绿素b，叶绿素a对甜荞米褐变的影响大于叶绿素b。甜荞米中酚类物质对褐变有影响，对于选取的总酚含量低(通荞2号)、中(赤甜1号)、高(品甜2号)的3个甜荞米品种，通荞2号的总酚对褐变的影响最低。品甜2号褐变程度最大，褐变速率最快。从褐变的角度考虑，可以适度选择总酚含量相对较低的甜荞米品种储藏。PPO参与了褐变过程，对甜荞米褐变影响低于酚类物质，其作用于酚的酶促褐变在储藏初期的作用大于储藏后期。

甜荞米褐变是多因素多通路共同作用的结果，其中，叶绿素、酚类物质和PPO不同程度地影响甜荞米褐变：叶绿素影响最大，总酚次之，PPO最小。